自噬在VEGFR2介导的胶质瘤干细胞形成血管拟态中作用的研究

We and others have demonstrated that glioma stem cells (GSCs) is important for the formation of vasculogenic mimicry (VM). Furthermore, we found that VEGFR-2 highly expressed on GSCs plays a critical role in VM formation, and GSCs could form VM and generate phosphorylation of VEGFR-2 in the absence of VEGF, suggesting that VEGFR-2 could be activated by VEGF-independent. Moreover, autophagy occurred during VM formation by GSCs in the absence of VEGF. Thus, we propose that autophagy may be the activation pathway by which VEGFR-2 is activated independent of VEGF, and that autophagy formed by GSCs deficient in nutrition and VEGF activates VEGFR-2, thereby promoting VM formation in tumor. To address whether "autophay is the mechanism underlying VM formation without VEGF participation", we will employ 3-D scaffold and xenograft tumor model as our major research tools to explore the role of autophagy in the GSCs-mediated formation of VM and the underlying mechanisms. We will also search the potential molecules that may regulate the process by which autophagy activates VEGFR-2 on GSCs. The results yielded from our proposed study will provide novel methods and foundation to facilitate the development of novel therapy targeting GSCs and VM formation.

我们及国外研究均证实胶质瘤干细胞(GSCs)是血管拟态(VM)形成的关键细胞。在机制研究中我们发现GSCs高表达的VEGFR-2在其形成VM中起关键作用。同时也观察到在无VEGF时GSCs仍能形成VM，并检测到VEGFR-2磷酸化，且形成的VM中存在自噬。提示，VM形成过程中VEGFR-2活化可能存在不依赖VEGF的途径。我们推测，自噬可能是GSCs VEGFR-2非VEGF依赖的活化途径之一，GSCs在体内缺乏营养和VEGF等微环境作用下形成的自噬，通过活化其高表达的VEGFR-2，促肿瘤组织VM形成。本课题围绕"自噬在GSCs形成VM中的作用及机制"这一关键科学问题，以三维支架及动物移植瘤为主要模型，对自噬在GSCs形成VM中的作用及其相关机制进行深入研究，并探讨自噬活化GSCsVEGFR2及形成VM的主要调控分子，为针对GSCs及其VM的靶向治疗提供新理论、新方法。

已证实胶质瘤干细胞(GSCs)是血管拟态(VM)形成的关键细胞。在机制研究中我们发现GSCs高表达的VEGFR-2/KDR在其形成VM中起关键作用。同时也观察到在无VEGF时GSCs仍能形成VM，并检测到VEGFR-2磷酸化，且形成的VM中存在自噬。提示，VM形成过程中VEGFR-2活化可能存在不依赖VEGF的途径。本课题围绕“自噬在GSCs形成VM中的作用及机制”这一关键科学问题展开研究，发现（1）自噬抑制剂氯喹具有抑制贝伐单抗促VM形成的作用：将GSCs原位种植于裸鼠颅内，尾静脉分别注射贝伐、氯喹及氯喹+贝伐，结果显示，贝伐注射组微血管密度明显降低，而VM数量明显增多；氯喹注射组微血管密度与对照组相比几乎无变化，但VM数量明显减少；氯喹+贝伐联合注射组微血管密度显著降低，且氯喹可显著抑制由贝伐引起的VM形成。（2）自噬参与了GSCs形成VM：GSCs在EBM培养下形成VM样结构明显增多。自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG7和ATG5表达水平显著提高。LC3与VM相关蛋白在VM样结构的细胞中存在共表达。（3）自噬激动剂通过活化VEGFR-2促进血管拟态的形成：在EBM中加入RAPA，瘤细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例增加，同时SQSTM1表达水平下降；并可检测到VEGFR-2-1175位点磷酸化水平升高，同时VM形成相关蛋白表达水平升高。（4）自噬通过非VEGF依赖途径活化VEGFR-2促进VM的形成：氯喹处理后，GSCs形成的VM明显减少，VEGFR-2-Y1175位点的磷酸化水平降低，加入贝伐后，VEGFR-2-1175位点磷酸化明显增强，而氯喹可抑制此效应。下调ATG5后，VM相关蛋白表达明显下降，且VEGFR-2-1175位点磷酸化水平下降， VM形成明显减少。将ATG5下调细胞移植入裸鼠体内，贝伐单抗丧失了促进VM形成的能力。（5）自噬通过ROS调控VM的形成：当加入CQ抑制自噬时，VM形成减少的同时伴有ROS水平的下降。在贝伐单抗和抗氧化剂 N-acetylcysteine（NAC）同时处理后VEGFR-2磷酸化水平显著降低，但LC3和SQSTM1表达无变化。（6）VM密度高的胶质母细胞瘤病人的总生存期和无进展生存期均较VM数量低组短，预后差。本项目首次揭示了自噬通过活化VEGFR-2介导胶质瘤VM形成，并明确了靶向GSCs源性VM的治疗学意义。