三羧酸循环代谢通路在人工牛黄配伍双氯芬酸钠、扑尔敏致肾毒性中的网络调控作用机制

The Krebs Cycle is the hub and center of material and energy metabolism in the body, which upstream and downstream metabolites play a role of bridge and link in the metabolic network. The Chinese-Western Medicine Compound of Ganmaotong, composed by artificial bezoar, diclofenac sodium and chlorpheniramine, appeared a lot of blood urine in the process of clinical use, while the renal toxicity mechanism is not yet clear. On the basis of previous research, in order to fully explain the internal mechanism of compability induced renal toxicity, taking rat models with different doses and combination of drugs as study carrier, relying on modern chromatography - mass spectrometry (LC-MS、GC-MS) and data mining (SIMACA-P、Metabo Analyst、Python、R language) technologies, the metabolic markers of the renal toxicity were screened in serum, urine and kidney. Then, targated analysis was applied to reveal the network regulation mechanism of the Krebs Cycle metabolic pathways in artificial bezoar compatibility of diclofenac sodium and chlorpheniramine induced renal toxicity. The predictable success of this project will provide new ideas for studying of the interaction mechanism and safety evaluation of Chinese-Western medicine compound.

三羧酸循环是生物体内物质代谢和能量代谢的枢纽和中心，其上下游代谢产物在肾毒性代谢网络中起到桥梁和纽带作用。中西药复方制剂感冒通( 人工牛黄、双氯芬酸钠、扑尔敏)在临床使用过程中出现大量血尿不良反应，其肾毒性机制尚未明确。为全面阐释人工牛黄配伍双氯芬酸钠、扑尔敏致肾毒性的内在机制，本项目以不同剂量、配伍组大鼠模型为研究载体，利用现代色谱-质谱联用技术(LC-MS、GC-MS)和数据挖掘技术(SIMACA-P、Metabo Analyst、Python、R语言)，筛选各组大鼠血清、尿液、肾脏中可指示人工牛黄配伍双氯芬酸钠和扑尔敏导致肾毒性的代谢标志物，靶向分析三羧酸循环代谢通路在人工牛黄复方配伍致肾毒性中的网络调控作用机制，构建“剂量、配伍、毒性、网络调控”之间的深层关联及其网络调控体系。所建立的分析策略和关键技术体系可为中西药复方的安全性评价及药物间的相互作用机制研究提供新的思路和借鉴。

复方双氯芬酸钠马来酸氯苯那敏片（Compound diclofenac sodium chlorphenamine maleate tablets, CDCT）是常用于缓解感冒引起的头痛、发热、咳嗽、鼻塞症状的感冒药。血尿是CDCT在临床使用中出现的最普遍的毒副作用而限制了其临床应用。本课题采用代谢组学方法，以期揭示CDCT致肾毒性的作用机制，为临床应用提供理论依据。本课题主要从以下三个方面开展研究：（1）本课题参照CDCT处方剂量，采用人工牛黄、双氯芬酸钠、马来酸氯苯那敏复制大鼠血尿症状模型，观察并记录大鼠出现血尿的时间和存活时间，利用HE染色法观察肾组织病理变化，用生化分析试剂盒检测大鼠肾功能（BUN、CRE）和炎症因子水平（IL-1β、IL-6、TNF-α）。（2）采用代谢组学技术筛选出CDCT诱导急性肾损伤大鼠血液和尿液中的潜在生物标志物。利用Progensis Qi对数据进行前处理，SIMCA-P软件进行多元统计分析（PCA、OPLS-DA），HMDB、Metlin等数据库对变量进行性定性分析，Metaboanalyst软件绘制通路富集图。（3）依据代谢组学筛选的标志物，通过ELISA法定量分析LTB4的含量、Tunel 法观察肾组织凋亡水平、Western blot法考察CL、LTB4所涉及的凋亡和NF-B信号通路中的Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9，p65，IκBα，p-p65，p-IκBα蛋白的表达水平。研究结果表明：给药CDCT的大鼠，在第三天开始出现血尿症状，并出现死亡现象，说明出现肾毒性；肌酐、尿素氮水平异常升高表明肾功能损害；肾组织病理出现肾小管上皮细胞变性和坏死，管腔扩张和肾小球萎缩，偶有充血，同时还伴有坏死和炎细胞浸润；IL-6、IL-1β在药物组的含量明显升高，表明有炎症发生。血清、尿液代谢组学共筛选出28种代谢物，根据VIP、FC、AUC、FDR值并结合既往文献，最终筛选出心磷脂和LTB4为CDCT诱导急性肾损伤的关键性代谢物。药物组促凋亡蛋白Bax显著性上调表达，而抗凋亡蛋白Bcl-2则明显下调表达。在Cyt-c 表达增多的情况下，caspase-3和caspase-9含量表达也急剧增加；p-p6，p-IκBα以及核p65的表达明显升高，而IκBα的表达下调，进而促发炎症级联反应。