缺氧肿瘤细胞抑制ITGA3分泌的机制研究

As solid tumors grow, those areas distant from the existing blood vessels can become chronically or intermittently hypoxia. These hypoxic conditions place tremendous pressure on tumor cells and drive development of increasingly malignant and metastatic phenotypes. In our previous studies of whole proteomics and glycol-proteomics for A431 cancer hypoxia, many pathways were found modulated by hypoxia, some of which were found with positive effects on cell migration. The changes of integrin alpha 3 (ITGA3) induced by hypoxia were interesting: independent of its protein level change, N-glycosylation modifications of ITGA3 were inhibited by hypoxia, which prevented its efficient translocation to the plasma membrane and promoted cell invasion under hypoxia. Mutagenesis studies demonstrated that simultaneous mutation of glycosites 6 and 7 of ITGA3 prevented its accumulation at K562 cell surface, which blocked integrin alpha 3 and beta 1 heterodimer formation and thus abolished its interaction with extracellular ligands. The conformation changes due to lack of glycans on sites 6 and 7 should be the keys to open the mysterious doors to reveal the interaction of integrin α3β1 complex. Immunoprecipitation and proteomics will be used to find ITGA3 partners which help its traffic to plasma membrane and binding orders. It could give clues for underlying mechanism behind ITGA3 secretion and metastatic cascades and provide new insights in the studies on cancer cell hypoxia and novel information for understanding glycoprotein secretion.

由于肿瘤细胞快速生长引起的缺氧，随着肿瘤细胞的适应性调控， 成为促进肿瘤恶化和迁移的重要原因。我们对缺氧肿瘤细胞的全、糖蛋白质组变化及随后的功能研究表明：肿瘤缺氧通过调控多条信号传导通路促进其迁移。其中，我们注意到缺氧调控的ITGA3的变化比较特殊：其蛋白表达总量没有明显的变化，仅在糖基化修饰上有明显的减少，因此导致其分泌到细胞膜上的量显著下降，从而提高细胞侵袭。我们进一步的研究发现其第6和7位点的糖基化修饰同时阻断会导致其分泌的完全缺失。可能正是由于糖链的缺失引发的结构变化，导致其无法与协作蛋白结合而无法分泌。我们拟主要采用IP结合蛋白质组学方法，以无分泌突变型为对照，鉴定ITGA3分泌过程中的动态蛋白质相互作用网络及作用顺序，并揭示这些蛋白对缺氧肿瘤细胞中ITGA3分泌及对细胞功能的影响。对于这种新型机制的揭秘可以填补目前研究的空白，并有利于发现肿瘤缺氧对细胞迁移调控的新方向。

我们发现ITGA3蛋白的第6和7位N-连接糖基化修饰被阻断后，该蛋白无法被转运到细胞膜。而一旦ITGA3在细胞膜上缺失后，会大大提升缺氧条件下肿瘤细胞的迁移性。本研究预采用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质组学结合的方法，以无分泌突变型ITGA3-M6-7为对照， 鉴定ITGA3分泌过程中的动态蛋白质相互作用网络及作用顺序，寻找帮助ITGA3分泌到细胞膜的转运蛋白。并揭示这些蛋白对缺氧肿瘤细胞中ITGA3分泌及对细胞功能的影响。.. 我们首先确认了突变型ITGA3不可通过内质网检测点进入高尔基体；随后，我们在全细胞水平、亚细胞器水平、不同pH值条件下分别进行了ITGA3的常规Co-IP实验和LC-MS/MS质谱鉴定，同时也进行了cross-linking交联处理后的ITGA3 Co-IP实验和LC-MS/MS质谱鉴定，发现了多个潜在的ITGA3-WT特异结合蛋白，但是在常规Co-IP实验中那些被重复鉴定到的结合蛋白都是一些与ITGA3转运不太相关的蛋白；而在cross-linking交联处理后的ITGA3 Co-IP实验中，即使进行了大量的优化，也一直无法鉴定到和ITGA3直接结合的蛋白；仅发现帮助第6和7位N-连接糖基化位点突变后的ITGA3错误折叠的结合蛋白。.. 我们认为由于目标蛋白ITGA3在细胞中表达量不高，而与之结合的蛋白往往是瞬时的或是丰度非常低的，所以采用目前的技术很难发现帮助膜上ITGA3糖蛋白转运的结合蛋白。但是，在项目执行过程中，为了提升Co-IP复合物中少量蛋白的鉴定，我们发展了一种毛细管色谱柱装置及高效分离方法，该方法的专利已受理。同时进行了技术的改进以及方法学的优化，以期提升膜蛋白复合物的鉴定，虽然优化后的方法仍无法锁定ITGA3转运蛋白，但是该方法对于低丰度缺失蛋白的鉴定有明显的提升，因此在《Journal of Proteome Research》上发表文章一篇。