基于纳米抗体的高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）快速诊断方法的研究

High-risk human papilloma virus (HR-HPV) is a major cause of cervical cancer. China's xinjiang uygur community is a high incidence area and there is no effective method that can satisfy both high sensitivity, simple operation and lower-cost at the same time. For variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody(VHH) is the smallest antigen-binding antibody shows low immunogenicity and easy for manufactured and expressionn. It is suggested to be an ideal antibody for immune diagnosis and treatment. In our study, we want to make HPV capsid protein L1 which contains multiple neutralizing activity of antigen epitope and oncoprotein E6/E7 as target proteins to construct camelus bactrianus-derived single-chain antibody library. The purpose is to obtaine specificity VHH towards to L1 and E6/E7 protein by yeast two-hybrid. Verified the function of VHH by ELISA, Western blot, immunocytochemistry and neutralization test. Finally, combined with colloidal gold labeling technology. Optimized each component and system of immune chromatography and assembled test strip. We are going to research a new rapid antigen capture diagnostic method which is sensitive, specific, rapid and easy to operate, no need for equipment and professional staff, easy for interpretation and lowest cost. We hope it will be useful for early screening and prevention of cervical cancer.

宫颈癌是影响女性健康的重大恶性疾病，新疆是宫颈癌的高发区。目前宫颈癌筛查仍然是预防宫颈癌的主要防御手段。人乳头瘤病毒（HPV）是引发宫颈癌的主要病因，现有的HPV检测方法存在敏感性差、操作繁琐、设备和技术人员要求高、价格偏高等不足，急需研发一种适合基层偏远地区、低收入人群筛查需要的检测技术。基于纳米抗体（VHH）具有高抗原结合性，低免疫原性、容易制造和表达，本项目拟选择HR-HPV壳蛋白L1和标志细胞发生癌变的E6/E7为检测标志物，通过免疫羊驼，构建文库，酵母双杂交方法筛选和验证与L1、E6/E7蛋白具有最强结合力的VHH，并验证其敏感性和特异性。采用胶体金标记VHH抗体技术，优化免疫层析各成分和体系，组装检测试纸条，研发快速、敏感、特异、易操作，无需仪器设备和专业人员，结果易判读，经济成本极低的HR-HPV抗原检测新技术，为宫颈癌的早期筛查和预防提供有效的诊断方法。

背景：宫颈癌是全球女性中常见的恶性肿瘤，高危型人乳头瘤病毒(High risk human papillomavirus，HR-HPV)的持续感染是癌细胞再次出现的一个重要的致病原因。HPV16 E6E7蛋白是主要的癌蛋白，通过破坏人体细胞增殖周期的正常调节，从而引起细胞永生化而持续恶性增殖，是宫颈癌发生的关键。明确新疆地区HPV的感染现状，基于HPV E6E7蛋白在筛查中的潜在作用，我们拟设计特异性强的单克隆抗体，组装胶体金试纸条，并建立一种快速、简便、准确的自取样筛查方法。内容：收集在石河子大学第一附属医院妇科门诊进行检查的339位进行薄层液基细胞学检查的妇女的宫颈刮片并收集患者临床诊断信息。设计HPV16 E6E7蛋白重组序列，并设计合成重组蛋白并制备单克隆抗体，以此建立双抗体夹心ELISA反应体系。与二代杂交捕获实验检测结果对比，验证抗体的有效性；制备胶体金，确定这些金标抗体的最佳标记浓度。组装成胶体金试纸条，优化试纸条组装条件。宫颈脱落细胞为实验样品对比胶体金试纸条与HC-2检测结果的符合率。结果：首先合成新的重组蛋白，最终制备出特异性最强的两株单抗，并建立检测 HPV16 E6E7双抗体夹心检测体系，确定包被抗体及酶标记抗体的最佳工作浓度。同时用建立的双抗体夹心ELISA方法与HC-2检测87份宫颈脱落细胞样本，将检测结果进行比较，统计分析后二者符合率达到83.7%，敏感性达87.7%。(2)通过对胶体金透射电镜扫描鉴定，胶体金制备成功，选择粒径在20 nm左右的的均匀球体。通过Mey氏系列稳定法组装胶体金试纸条，HPV16 E6E7标金单克隆抗体最佳浓度为 1.68mg/ml，灵敏度为87.5μg/ml，用该试纸条与 HC-2方法分别检测处理过的 150份临床样本，符合率达到78.7%。结论：根据HPV16 E6E7蛋白的表达情况的方法，实现患者的自检自测，可以根据试纸条的颜色变化被检查者可以轻松区分HPV的感染状态，然后才能采取及时的预防及治疗措施。