调控因子DegU对枯草芽孢杆菌NCD-2菌株fengycin合成的调控机理

Fengycin is the major antifungal lipopeptide produced by Bacillus subtilis NCD-2. Recent studies found that the regulator DegU gene deleted mutant significantly decreased the antifungal activity and fengycin production in strain NCD-2. To clarify the molecular mechanism of DegU on the fengycin synthesis, the DegU-regulated genes were identified using the RNA-seq, and the DegU-regulated proteins were identified using isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) techniques. The differentially expressed genes and proteins between NCD-2 wild-type and degU mutant were analyzed by bioinformatics. The genes that DegU-regulated and also involved in fengycin synthesis will be selected as target genes. Then, the function of target genes on the fengycin synthesis will be confirmed by gene deletion and complementation. By overexpression of the key genes in fengycin synthesis, the production of fengycin and biocontrol efficiency of strain NCD-2 will be increased hopefully. Gel retardation and footprint analyses will further characterize the interaction between the target genes and the promoter of the fengycin synthetase operon. These results will clarify the molecular mechanism of DegU on the regulation of fengycin synthesis, and that will be important for the application and genetic modification of strain NCD-2.

Fengycin是枯草芽孢杆菌NCD-2菌株产生的主要抑菌活性物质。前期研究发现，定位突变双因子调控系统DegU/DegS中的调控因子DegU显著降低NCD-2菌株fengycin的合成和抑菌活性。为明确DegU对fengycin合成的调控机理，本项目拟采用RNA-seq和iTRAQ蛋白质组学研究技术结合生物信息学方法，从mRNA水平和蛋白质水平上分析受DegU调控且与fengycin合成相关的目的基因；对目的基因进行缺失突变和功能互补分析，明确目的基因在NCD-2菌株fengycin合成和生防功能中的作用；通过对fengycin合成关键基因进行超表达，验证其对提高NCD-2菌株fengycin合成和生防效果的作用；通过凝胶阻滞试验明确关键基因与fengycin合成酶基因启动子的互作方式。预期结果将明确DegU对fengycin合成的调控机理，为更加合理利用NCD-2菌株提供科学参考依据。

菌株NCD-2是一株具有很好生防效果的枯草芽胞杆菌，产生的脂肽类抗生素fengycin在菌株发挥生防功能中起主要作用。DegU/DegS双因子调控系统是枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中重要的信号转导和基因表达调控系统，在本项目的资助下，研究了DegU/DegS对NCD-2菌株fengycin合成的调控机理。.首先，通过同源重组技术对菌株NCD-2的degU和degS进行了定位突变，并对突变体进行基因互补。抑菌活性测定表明，突变子显著降低了对番茄灰霉和立枯丝核菌的抑菌活性；通过FPLC检测fengycin的合成量明显降低温室防效测定表明，同突变子相比，野生型NCD-2菌株处理的土壤含菌量显著降低。明确了NCD-2菌株双因子调控系统DegU/DegS正调控生物膜形成、胞外蛋白酶和纤维素酶产生、swarming能力等生防相关性状。研究发现，突变degU和degS基因对NCD-2菌株的生长曲线无影响，但影响其菌落形态。.采用RNA-Seq转录组学技术和iTRAQ结合LC-ESI-MS/MS定量蛋白质组学技术，分析获得了野生型菌株NCD-2和degU突变子、degS突变子之间大量差异表达的基因和蛋白质。对差异表达的基因进行了GO分析、COG分析和KEGG通路分析，结果表明DegU调控的基因大部分与生物进程相关，DegS调控的基因大部分与细胞组成相关。进一步对转录组学和蛋白质组学数据进行联合分析，获得相对于野生型NCD-2，在degU突变子、degS突变子转录组和蛋白质组中均表现下调的13个基因。组学技术的应用挖掘出了更多与fengycin合成相关的基因，丰富了芽胞杆菌fengycin合成调控网络，为深入揭示NCD-2菌株fengycin合成的调控机理提供了科学的数据支撑。.通过表型芯片技术分析了degU和degS基因突变子与野生型菌株NCD-2在不同碳源、氮源、抗渗透压和pH值条件下的细胞表型差异，以及对不同抗生素和化学物质的敏感性差异。明确了15种碳源、多数氮源下的生长代谢受调控因子DegU调控；野生型菌株和突变子均对渗透压的忍受能力较强、对pH值的耐受范围较广；对不同化学物质的敏感性差别明显。分析数据对菌株NCD-2生产中提升发酵菌体总量，应用中避免化学物质的影响提供了理论指导意义。