枯草芽孢杆菌NCD-2菌株Fengycin合成酶基因上游调控因子的克隆和功能分析

Fengycin作为枯草芽孢杆菌NCD-2产生的主要抑菌物质，在防治棉花黄萎病中起着重要作用。目前，本课题组已完成NCD-2菌株的全基因组测序，获得了编码Fengycin的基因。为了提高NCD-2菌株产生Fengycin的能力，本项目拟对Fengycin合成酶基因FenC进行lacZ标记，通过转座子插入突变技术，筛选并克隆影响Fengycin合成酶基因表达的上游调控因子；并对所克隆的调控因子进行功能验证和DNA结合位点分析，从而明确调控因子在NCD-2菌株中的作用模式以及对Fengycin合成酶基因表达的影响。通过此项研究，可获得影响NCD-2菌株Fengycin合成酶基因表达的重要调控因子，明确该调控因子对Fengycin合成的影响，对有目的的提高NCD-2菌株中Fengycin的产量和构建高效生防工程菌株提供重要依据；同时，对其它枯草芽孢杆菌中抑菌物质合成途径的研究具有理论借鉴意义。

在该项目的资助下，明确了fengycin是枯草芽孢杆菌NCD-2菌株产生的主要抑菌活性物质。从NCD-2菌株中分离出抑菌活性物质—fengycin，并克隆出fengycin合成酶基因。通过同源重组技术对fengycin合成酶基因进行了定位突变，突变子丧失fengycin合成能力。抑菌活性测定表明，fengycin合成酶基因突变子显著降低了对番茄灰霉病菌和立枯丝核病菌的拮抗活性，温室防效测定表明，同NCD-2菌株野生型相比，突变子降低了对棉花立枯病的防治效果并显著降低了棉花根际立枯丝核病菌的群体数量。从NCD-2菌株中克隆出2个fengycin合成酶基因上游调控因子—phoR/phoP双因子调控系统和degQ基因。通过对phoP基因进行定位突变和互补分析，证明phoR/phoP双因子调控系统正调控NCD-2菌株的抑菌活性和fengycin的合成，同phoR基因相比，调控因子phoP对fengycin合成的调控作用更明显。通过对fengycin合成酶基因启动子区域的DNA序列进行分析，未发现PhoP的识别位点，因此，PhoP与fengycin合成酶基因启动子为间接结合。RT-PCR试验结果证明，phoP从转录水平调控fengycin合成酶基因的转录。通过生理生化指标鉴定和16S rDNA序列分析无法对枯草芽胞杆菌及其近缘种进行准确的分类鉴定。本项目首次报道了根据phoR基因序列可对枯草芽孢杆菌及其近缘种进行分类鉴定，同目前国内外常用的gyrB基因相比，phoR基因序列在芽孢杆菌属不同种之间的遗传变异更明显，对不同种的芽胞杆菌鉴定结果更准确。通过对degQ基因进行定位突变和互补分析，证明degQ基因正调控NCD-2菌株的抑菌活性、fengycin的合成以及生物膜的产生，凝胶迁移试验证明，DegQ与fengycin合成酶基因属于间接互做。通过RT-PCR试验证明，突变DegQ基因可使fengycin合成酶基因的转录水平显著降低。此外，在本项目的资助下，我们对NCD-2菌株生物膜形成和芽胞产生进行了部分研究，明确了ywbB基因对NCD-2菌株生物膜形成的调控作用和ywbD基因对NCD-2菌株芽胞产生的作用。本项目的研究成果发表学术论文5篇，会议论文5篇，申请国家发明专利1项。培养研究生2名。