L-脯氨酸对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成的调控机理

Biofilm formation plays a very important role in root colonization and Verticillium wilt control by Bacillus subtilis strain NCD-2. Previously studies revealed that L-proline is an important substance in cotton root exudates, and has a significant positive effect on biofilm formation of strain NCD-2. However, the regulation mechanism of biofilm formation is not clear by L-proline. To clarify the molecular mechanism of L-proline on the biofilm formation, the regulated genes were identified using the RNA-seq, and the regulated proteins were identified using isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) techniques. The differentially expressed genes and proteins that L-proline-regulated were analyzed by bioinformatics. The genes that L-proline-regulated and also involved in biofilm formation will be selected as candidate target genes. Then, the function of target genes on the biofilm formation and root colonization will be confirmed by gene deletion and complementation. The interaction between the target genes and the promoter DNA of the biofilm formation synthetase operon will be examined by both bacterial two-hybrid and electrophoretic mobility shift assay. These results will clarify the molecular mechanism of L-Proline on the regulation of biofilm formation, enrich the regulatory network of biofilm formation, and will further explain the colonization difference of strain NCD-2 in different cotton varieties, and provide a reference for genetic improvement and scientific application of strain NCD-2.

生物膜形成是枯草芽胞杆菌NCD-2在根际定殖和有效防治棉花黄萎病的关键因素之一。前期研究发现，L-脯氨酸是棉花根系分泌物中重要的物质且对NCD-2菌株生物膜形成具有显著促进作用，然而该物质是如何调控生物膜形成的机制尚不清晰。为明确其对生物膜形成的调控机理，本项目拟采用RNA-seq和iTRAQ蛋白质组学技术结合生物信息学方法，从mRNA水平和蛋白质水平分析受L-脯氨酸调控且与生物膜形成相关的差异基因（或蛋白）作为候选目的基因；对目的基因进行缺失突变和功能互补分析，验证目的基因在生物膜形成和根际定殖中的功能；通过细菌双杂交和凝胶阻滞试验明确目的基因及其与启动子DNA的互作方式。预期结果将阐明L-脯氨酸对NCD-2菌株生物膜形成的分子调控机理，丰富NCD-2菌株生物膜形成的调控网络，深层次解释NCD-2菌株在不同棉花品种产生定殖差异的原因，并为NCD-2菌株遗传改良和科学合理使用提供参考依据。

生物膜形成是枯草芽胞杆菌NCD-2在根际定殖和有效防治棉花黄萎病的关键因素之一。NCD-2菌株在棉花品种“冀棉11”根际的定殖能力与其根系分泌物中的L-脯氨酸相关。以NCD-2菌株为供试材料，外源添加浓度L-脯氨酸共培养后，分别进行转录组（RNA-seq）和同位素标记相对定量蛋白组技术（iTRAQ）分析，对所获得的转录组和蛋白组数据进行生物信息学分析，利用RT-qPCR对不同代谢通路中26个差异基因的表达进行分析，并开展L-脯氨酸对NCD-2菌株的衍生突变菌株进行生物膜形成能力的比较测定。同时利用微生物组技术研究枯草芽胞杆菌NCD-2对棉花根际土壤中丰富和稀有物种群落的影响。结果表明，L-脯氨酸促进NCD-2菌株生物膜形成是通过诱导tasA基因的表达产生更多的胞外蛋白TasA。明确了L-脯氨酸与枯草芽胞杆菌NCD-2之间的互作存在一个复杂的生物过程，依赖于不同代谢通路网络中的多个基因。双组分系统、抗生素生物合成、能量代谢、运动或趋化作用、鞭毛组装和ABC转运蛋白通路中的差异基因（或蛋白）可能在棉花根系分泌物与枯草芽胞杆菌互作过程方面发挥着重要作用；明确了L-脯氨酸能够负调控突变菌株comA生物膜的形成，正调控phoP和phoR菌株生物膜的形成，而DegU/ywbB菌株生物膜的形成与L-脯氨酸不存在相关性；明确了NCD-2菌株对棉花黄萎病具有良好的防治效果,然而拌种处理对土壤中大丽轮枝病菌数量无显著影响；NCD-2菌株处理提高了土壤细菌和真菌多样性、改变了土壤微生物群落组成；NCD-2菌株处理丰富的细菌类群中，Acidobacteria, Chloroflexi和Planctomycetes 的丰度较高。Arenimonas、hydroophaga、Chaetomium、Aspergillus、Nectria、somathyrella、Conocybe和Chrysosporium的丰度也显著高于空白对照。BS处理的微生物群落结构与土壤铵态氮（NH4+-N）、无机磷（IP）和pH呈正相关，与硝态氮（NO3--N）、速效钾（AK）和有机质（OM）呈负相关。研究结果为阐明菌株NCD-2进行生态防治棉花黄萎病的机理提供理论依据。