猪瘟病毒非结构蛋白对猪巨噬细胞Toll样受体介导天然免疫应答的影响及机制

Toll-like receptors (TLRs) are fundamental sensor molecules of the host innate immune system, which detect conserved structures of virus and initiate innate immune responses via distinct signaling pathways. Paradoxically, viruses are obligate parasites that depend on host cells for survival and, throughout evolution, they have developed strategies to evade the immune response. Studies have confirmed that Classical swine fever virus (CSFV) and its non-structural proteins have significant effects on the expression of immune effectors participating in the signaling pathways of TLRs, but the the underlying mechanism remain poorly understood. Therefore, the purpose of this study is that the roles of swine TLRs will be determined in recognizing CSFV and related signal transduction via the changes of TLRs, type I IFNs and pro-inflammatory cytokines;Then the macrophage expressing CSFV non-structural proteins will be estabished, for determining the "strategic proteins" that affecting TLRs gene exspression, and analyzing the impact on downstream of TLRs signaling pathways. Furthermore, the "node proteins" in TLRs signal transduction pathway will be identified through studying the effect of CSFV"strategic proteins" on adapter proteins and key molecules in signaling pathways by pull-down, MS, co-IP and siRNA. Finally, the details of interactions between "strategic proteins" and "node proteins", and the interference of this interaction in the relative expression levels of effectors in signaling pathways will be explored. The results will indicate the effect of CSFV non-structural proteins on TLRs-mediated innate immune response and the underlying mechanism in swine macrophage.

Toll样受体（TLRs）通过介导天然免疫应答，产生免疫效应分子，对侵入机体的病毒进行清除，而病毒为了能够生存也会通过多种方式影响TLRs介导的免疫应答。我们研究发现猪瘟病毒及其非结构蛋白对猪巨噬细胞TLRs及其信号通路中免疫效应分子的表达有明显影响，但作用机制还不清楚。本项目拟在发现猪瘟病毒及其非结构蛋白对猪巨噬细胞TLRs介导免疫应答影响的基础上，在猪巨噬细胞中分别表达猪瘟病毒非结构蛋白，检测其对TLRs和免疫效应分子表达的影响，鉴定出具有明显作用的非结构蛋白（关键蛋白）；应用pull-down、co-IP、siRNA等技术鉴定与关键蛋白作用的TLRs信号通路中的关键位点（节点蛋白），明确关键蛋白调控免疫效应分子表达的信号转导通路，阐明猪瘟病毒非结构蛋白对猪巨噬细胞TLRs介导免疫应答的影响及机制。

Toll样受体（TLRs）通过介导天然免疫应答，产生免疫效应分子，对侵入机体的病毒进行清除，而病毒为了能够生存也会通过多种方式影响TLRs介导的免疫应答。项目旨在阐明猪瘟病毒非结构蛋白对猪巨噬细胞TLRs介导天然免疫应答的影响及机制。结果表明，CSFV石门株和C株感染均显著上调TLR2、TLR4和TLR7的表达，而石门株显著下调TLR3表达；CSFV Npro、NS2、NS3、NS3/4A、NS4B和NS5A均不能诱导NF-κB p65的激活；NS4B抑制猪巨噬细胞（pMDMs）中TLR3信号通路的激活，进而抑制TRIF mRNA转录、IRF3蛋白翻译和NF-κB p65磷酸化，最终影响IL-6和IFN-β分泌；NS5A可显著提高pMDMs中MyD88和IRF7的活性及IFN-α合成；酵母双杂交方法筛选出15个与Npro、26个与NS3、14个与NS4B相互作用的胞内蛋白；TRAF6与NS3相互作用，并通过促进NF-κB的激活而抑制CSFV复制；uS10与Npro相互作用，并通过上调TLR3表达抑制CSFV复制；Rab5与NS4B相互作用，促进NS4B诱导复合物的形成，并促进CSFV复制；TRAF5与NS3相互作用，并通过激活p38 MAPK而促进CSFV复制；FHC与NS4B相互作用，并通过稳定细胞内ROS水平而抑制细胞凋亡；Npro可通过降解IRF3来抑制MAVS介导的天然免疫因子表达和细胞凋亡，NS4A通过增强MAVS信号通路诱导IL-8的表达；ISG15通过抑制细胞自噬来抵抗CSFV的感染；IFITM1、IFITM2和IFITM3抑制CSFV在细胞中的增殖；胞内蛋白GBF1和Rab2在CSFV增殖中发挥重要作用。综上所述，研究发现CSFV石门株和C株感染均能显著上调TLR2、TLR4和TLR7的表达，而CSFV石门株显著下调TLR3的表达，筛选并鉴定出对TLRs信号通路具有显著影响的“关键蛋白”（Npro、NS3、NS4B和NS5A）；发现与CSFV Npro、NS3、NS4B相互作用的胞内蛋白，证明TRAF6与NS3、uS10与Npro、TRAF5与NS3相互作用，并参与CSFV复制及宿主的免疫调控过程。研究结果揭示了CSFV非结构蛋白与猪巨噬细胞TLRs介导天然免疫应答的相互关系，为阐明CSFV非结构蛋白的功能及病毒与宿主之间相互关系提供了新的科学资料。