Toll 样受体介导的巨噬细胞对prion清除的分子机制

巨噬细胞对于prion的传播与清除具有重要作用，这种作用依赖于Toll 样受体（TLRs），但是目前仅对prion 疾病与一个TLR或一个信号通路的关系有报道，对于巨噬细胞TLR 信号通路被prion 激活后,巨噬细胞对prion 的具体作用机制未见研究报道。本项目采用巨噬细胞Toll样受体（TLRs）信号通路基因芯片，筛选出PrPSc感染巨噬细胞后激活的所有TLRs及其信号通路。通过ELISA测定相关信号通路激活后细胞分泌的细胞因子含量；利用定制的基因芯片，筛选与吞噬作用相关差异表达基因，并观察细胞吞噬能力的变化；观察细胞对PrPSc的消化和降解能力的变化，研究相关TLRs信号通路激活后与巨噬细胞吞噬能力、对PrPSc清除作用的关系，从TLRs信号通路的角度阐明prion 疾病发生发展的分子生物学机制，为传染性海绵状脑病诊断和治疗的新靶点提供全新的思路和科学依据。

本研究在上一基金的基础上，首先检测了PrPC对巨噬细胞吞噬活性的影响，结果表明，Prnp-/- 小鼠的骨髓源巨噬细胞发生吞噬的巨噬细胞比例、平均吞噬的大肠杆菌数和吞噬指数（PI）都较高。免疫荧光结果表明：Prnp-/- 小鼠的骨髓源巨噬细胞的吞噬活性较WT小鼠升高，细胞内囊泡分子Rab5a、Rab7、EEA1 参与了PrPC调节的吞噬作用。使用prion 毒性多肽作用于巨噬细胞或巨噬细胞来源的小胶质细胞，表明有多个受体参与激活细胞的过程，如TLR2、CD36、RAGE受体以及整合素α5β1等，这些分子是否存在互作还需要进一步研究，这些分子均可引起感染巨噬细胞后 NF-κB信号通路激活，促炎因子IL-1β，IL-6，TNF-αmRNA和蛋白的水平上调，一氧化氮合成酶（iNOS）表达量上调，一氧化氮（NO）合成量增加。另外，检测小鼠骨髓来源的巨噬细胞吞噬过程中向细胞外分泌小囊泡的性质，结果表明，从Ana-1巨噬细胞系培养基中提取到的PrPC的小囊泡与exosomes 的特征相符；PrPC与Tsg101、Flotillin-1和Hsp70共同定位于所提取的exosomes上；在细胞内和分泌的exosomes上均可以检测到PrPC与Hsp70之间存在相互作用，但没有发现PrPC与Tsg101和Flotillin-1之间也存在相互作用。上述结果表明，巨噬细胞系可以通过分泌exosomes向细胞外环境中释放PrPC，这可能是运输和转运PrPC的通路之一。