猪瘟病毒NS4B蛋白对RLRs介导的天然免疫应答的影响及机制

Classical swine fever virus (CSFV) non-structural protein 4B (NS4B) plays an important role in virus replication. Our studies have found that CSFV NS4B inhibited the expression of IFN-β and IL-6 mediated by retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5) in porcine alveolar macrophages (PAM), but the mechanism remains unclear. Based on the inhibition of RLRs-mediated innate immune response by CSFV NS4B, this study will determine the mechanism of that NS4B regulated RLRs-mediated innate immune response. Firstly, the effect of NS4B on RLRs signaling protein-mediated innate immune response will be investigated. In addition, this project will select the “target proteins” interacting with CSFV NS4B by yeast two-hybrid screening, laser scanning confocal microscope, Co-IP and GST pull-down. Furthermore, the key domain and amino acid of NS4B that interacts with “target proteins” will be confirmed. The effect of “target proteins” on RLRs-mediated innate immune response will be analyzed by CRISPR/Cas9 knockout technologies, and the effect of NS4B, NS4B key domain and NS4B mutants on target proteins expression and function will be performed to clear the mechanism of RLRs-mediated innate immune response regulated by CSFV NS4B. The results will provide theoretical basis for revealing the role of NS4B in CSFV pathogenesis.

猪瘟病毒（CSFV）NS4B蛋白在病毒的复制过程中发挥重要作用，前期研究发现CSFV NS4B能抑制猪肺泡巨噬细胞中RIG-I和MDA5介导的天然免疫效应分子（IFN-β和IL-6）的表达，但其调控RLRs介导的天然免疫应答的机制还不清楚。本项目拟在此基础上，分析NS4B对RLRs信号通路蛋白介导的天然免疫应答的影响，进一步通过酵母双杂交、激光共聚焦、Co-IP、GST pull-down等技术筛选与NS4B相互作用的“靶点蛋白”，并确定NS4B与“靶点蛋白”相互作用的关键区域和位点。利用CRISPR/Cas9敲除技术分析“靶点蛋白”对RLRs介导天然免疫应答的影响，结合NS4B蛋白、NS4B关键区域和NS4B突变体对“靶点蛋白”的表达及其功能的影响，明确NS4B抑制RLRs介导的天然免疫应答的机制，为揭示CSFV NS4B在CSFV致病机理中的作用提供理论依据。

RIG-I样受体（RLRs）通过识别入侵病原体的病原相关分子模式介导天然免疫应答，在机体抗病毒免疫中发挥着重要作用。项目旨在明确猪瘟病毒（CSFV）NS4B抑制RLRs介导的天然免疫应答的机制，结果发现CSFV感染诱导PAMs细胞中IL-8 mRNA和蛋白表达，但CSFV NS4B下调IL-8的表达；CSFV NS4B抑制MAVS介导的IL-8表达；CSFV NS4B与MAVS存在相互作用，但CSFV NS4B对MAVS的mRNA和蛋白表达没有显著影响，表明CSFV NS4B可能通过与MAVS相互作用，而不是通过影响MAVS的表达，抑制MAVS介导的IL-8表达。进一步研究发现NS4B抑制MAVS介导的NF-κB活化和IRF3表达，揭示了CSFV NS4B与MAVS相互作用，通过阻断IRF3和NF-κB的激活，抑制MAVS诱导的IL-8表达。研究发现过表达TBK1能够抑制CSFV基因组复制，且促进IFN-β和IL-6的表达，表明TBK1在CSFV感染过程中可能通过促进IFN-β和IL-6的表达发挥抗病毒作用，证明NS4B C端结构域与TBK1相互作用，确定了NS4B蛋白与TBK1结合的关键区域。研究发现过表达MDM2在病毒复制中期促进CSFV基因组的复制；过表达EEF1E1在病毒复制早期和晚期抑制CSFV基因组的复制，在病毒复制中期促进CSFV基因组的复制；过表达LGALS1在病毒复制中期促进CSFV基因组的复制。发现TRAF5促进PAMs细胞中ERK1/2的激活。综上所述，本研究明确了NS4B蛋白与“靶点蛋白MAVS”相互作用，抑制MAVS介导的NF-κB激活和IRF3的表达，从而抑制MAVS介导的IL-8表达的机制。确定了NS4B蛋白与TBK1结合的关键区域，且TBK1在CSFV感染过程中可能通过促进IFN-β和IL-6的表达发挥抗病毒作用。研究结果明确了CSFV NS4B抑制MAVS介导的IL-8表达的机制，为揭示CSFV NS4B在宿主天然免疫反应中的作用提供新的科学资料。