TNF-α介导的NF-κB 和Wnt通路正反馈调节促进LGR5+结肠干细胞恶变的分子机制

Chronic inflammation is an inherent feature of colorectal cancer microenvironment. Such persistent exposure causes DNA damage and abnormal activation of NF-κB and Wnt pathways, resulting in the malignant transformation of quiescent LGR5+ intestinal stem cells. Inflammatory cells and cytokines promote tumorigenesis through crosstalk between Wnt and NF-κB pathways, but its underlying mechanism remains unclear..Our previous work revealed increased DNA damage and decreased expression of GSK3, a negative regulator the Wnt pathway, after TNF-α stimulation in tumor cells. This proposal is to address whether the negative regulation of the inflammatory signal through GSK3β can affect the deterioration of stem cells. In order to investigate possible molecular mechanisms of the uncontrolled inflammatory stimulation-induced malignant transformation of colon stem cells and how TNF-α regulates the Wnt pathway through GSK3β suppression, we will employ western blot, Chip, EMSA, Single-cell sequencing and Luciferase reporter gene technologies. The project focuses on the intracellular crosstalk between NF-κB and Wnt pathways to address how TNF-α/GSK3β/Wnt signaling pathways regulate the differentiation and oncogenesis of colonic stem cells and to provide a potential new therapeutic target for the screening and identification of tumor related diseases and new drugs.

慢性炎症是结肠肿瘤微环境中的一个固有的特点。长期在此条件下导致DNA损伤及NF-κB和Wnt通路异常激活，使静止期的LGR5+肠干细胞恶性转化。炎症细胞因子在Wnt和NF-κB通路的交互作用下促进肿瘤发生，其相互作用机制不清楚。前期工作表明肿瘤细胞有明显DNA损伤，TNF-α刺激后Wnt通路负调控元件GSK3β表达被抑制。本项目为探讨非可控条件下炎症信号是否通过GSK3β的负调控作用影响干细胞恶化。项目拟采用western blot、CHIP、EMSA、单细胞测序和荧光素酶报告基因等技术，阐明TNF-α通过抑制GSK3β激活Wnt通路的分子机制，揭示非可控炎症刺激下诱发成体干细胞去分化的可能机制。该项目将从细胞内Wnt和NF-κB通路互作着手，揭示TNF-α/GSK3β/Wnt信号通路如何调节结肠干细胞去分化和肿瘤发生，为肿瘤相关疾病及新药的筛选鉴定提供潜在的新治疗靶点。

结肠癌在我国的发病显示出逐年的高发性和年轻化，发病率和死亡率仅次于前列腺癌/乳腺癌和肺癌。肿瘤的发生不仅依赖于其DNA突变、信号通路异常等，同时也受到肿瘤微环境的调控，因此，分析非可控性炎症与恶性肿瘤相互作用的动态调控网络是一个十分重要的科学问题。本项目基于以往研究，从细胞内Wnt/β-catenin和NF-κB通路互作着手，揭示TNF-α/AKT/Wnt信号通路如何调节结肠干细胞去分化等，为进一步阐明结直肠肿瘤发生发展、复发转移的分子机制提供理论依据，并为结直肠肿瘤标记物的筛选以及分子靶向药物开发提供全新证据。通过无血清悬浮培养获得结肠干细胞以及结肠癌干细胞，以炎症细胞因子TNF-α对其进行诱导，建立细胞炎症模型，研究TNF-α对结肠干细胞生物学行为的影响，以及NF-κB和Wnt/β-catenin通路在此过程中的作用；通过基因敲低或通路抑制剂分别对PI3K/AKT、NF-κB和Wnt/β-catenin通路进行活性调控，研究炎症细胞因子TNF-α对结肠干细胞恶性转变、结肠癌干细胞增殖凋亡、侵袭转移的影响，以及NF-κB和Wnt/β-catenin通路在此过程中作用的分子机制。实验结果表明：无血清悬浮培养可富集具有干细胞特性的球细胞NCM460s、HT-29s和SW620s，以Lgr5作为结直肠肿瘤标志物分选的SW620Lgr5+ CSCs具有更高的增殖能力与耐药性，提示Lgr5可作为结直肠肿瘤的药物靶点，具有潜在的临床应用价值；TNF-α可诱导NCM460s、CD44+CD133+HT-29、SW620Lgr5+ CSCs细胞发生炎症反应，促进其恶性转变及侵袭转移；TNF-α通过活化PI3K/AKT通路促进CSCs的增殖，并调控Wnt信号通路的活性来干预人结肠癌干细胞的的侵袭能力，而NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路之间的交叉调控促进人结肠上皮干细胞的恶性转变。综上，炎症因子TNF-α通过AKT的活化影响Wnt/β-catenin通路的异常激活， 同时通过NF-κB通路的激活，TNF-α作用获得加强， 从而进一步激活AKT/Wnt 通路，形成可循环的调控信号。NF-κB通路和Wnt/β-catenin通路在此过程中具有交叉调控的作用，其机制丰富了结肠肿瘤发生发展、复发转移的理论体系，对非可控性炎症导致的结肠肿瘤的预防和诊疗都有重要意义。