长效融合重组药物蛋白在毕赤酵母中表达策略

在已实施了多个融合蛋白药物多肽/蛋白在Pichia pastoris系统中进行表达的基础上，拟开展融合蛋白表达效率与宿主生理条件关联性的研究。选择已完成建立的融合药物多肽/蛋白基因为研究材料，定量PCR采集表达系统转录水平中融合基因mRNA量和质的信息，计算生物学模拟推导，调整表达体系的构建。结合基因定位突变，免疫电镜技术和同位素示踪，对翻译、分泌过程进行跟踪，分析低水平表达的主要原因；利用密码子偏好性、mRNA结构分析，对融合基因进行改造和实验验证，修正表达体系的构建。采用细胞生物学、免疫化学和生物化学技术对表达过程中宿主蛋白酶系变化对表达产物的影响进行分析，通过化合物阻断、基因敲除等验证。在此基础上分析造成融合基因表达差异的主要原因，提出融合基因构建、宿主细胞匹配准备和培养基配方设计的主要策略。项目的实施，有望解析融合蛋白在Pichia pastoris系统中表达的共性问题。

在已实施的多个融合蛋白药物多肽/蛋白在毕赤酵母（Pichia pastoris）系统中进行表达的基础上，开展了融合蛋白表达效率与宿主生理条件关联性的研究。收集整理信息，分析影响表达量的关键因素，建立和训练表达量的预测模型。结合研究组前期研究结果，重点对毕赤酵母表达系统中(1)不同启动子、(2)内质网折叠加工过程以及(3)蛋白质组学方面开展研究，并进行基因工程改造的尝试。主要包括共表达分子伴侣PDI增强HSA-IFNβ融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达；HSA融合蛋白表达过程中降解机制初步探索及主要降解片段的性质分析；3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子GAP调控下的IL2-HSA融合蛋白在毕赤酵母中分泌表达。由于不同药物融合蛋白在毕赤酵母中分泌表达均出现不同程度降解这一共性问题， 选择已完成的融合药物多肽/蛋白基因为研究材料，系统分析了毕赤酵母分泌途径中蛋白酶（GPI-linked aspartyl protease）家族成员与融合蛋白分泌表达过程中降解的相关性。通过构建重组酶Cre介导自剪切去除标签的敲除载体，获得一系列天冬氨酸蛋白酶单基因及多基因的缺陷菌株，并分析融合蛋白在蛋白酶缺陷菌株中的分泌表达。通过定点突变、基因合成等手段等对融合基因尤其是白蛋白HSA本身分子结构进行了再改造，并分析这些突变分子在毕赤酵母中的分泌表达情况，为优化融合蛋白基因设计，促进药物融合蛋白的分泌表达，修正表达体系的构建提供了思路。在此基础上分析造了成融合基因表达差异的主要原因，提出融合基因构建、宿主细胞匹配准备和培养基配方设计的主要策略。项目的实施，深入了对融合蛋白在毕赤酵母中分泌表达机制的了解，丰富了融合蛋白在毕赤酵母表达系统中优化表达的策略。