长效胰高糖素样多肽-1在毕赤酵母表达过程中的N端降解机制

本课题拟应用系统生物学原理，采用反向代谢工程的手段研究长效人胰高血糖素样肽-1表达过程的N 端降解问题。首先对已构建的表达长效人胰高血糖素样肽-1药物分子的重组毕赤酵母菌株进行传统诱变，通过高通量筛选获得表达量及N端降解程度等表型明显不同的突变株；应用蛋白组学技术分析不同表型突变株之间的蛋白表达谱差异，利用生物信息学结合肽谱测序技术确定影响白蛋白融合蛋白药物分子降解的关键差异蛋白（基因型）的范围；在此基础上，提出理性的毕赤酵母表达宿主的改造策略，并进行初步尝试，以期获得高表达低降解的长效人胰高血糖素样肽-1药物分子的毕赤酵母表达体系。本课题的实施可以对毕赤酵母降解蛋白药物分子相关途径进行较为系统性研究，预期可以提出理性的毕赤酵母表达宿主的改造策略，为解决毕赤酵母表达外源蛋白过程中目的分子的降解问题提供新的思路和技术手段。

毕赤酵母宿主对蛋白药物分子的降解已成为限制其成药性共性问题。本课题首先建立了双层硝酸纤维素膜结合抗体筛选的模型，筛选获得了表达量较高提高了20-30%，且N端降解程度不同的菌株，利用蛋白质组学技术在不同降解程度的突变株的胞内可溶性蛋白中共鉴定了32个差异蛋白，包括与碳源代谢、氨基酸代谢、能量代谢、翻译、次级代谢相关的蛋白及一些未知功能的蛋白,有STE13及YSP1基因与蛋白的N端降解相关。而后采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因，得到STE13缺陷型菌株GS115/D13。纯化产物生物活性实验结果显示，在相同的给药浓度梯度情况下，STE13基因缺陷型菌株GS115/D13中表达产物GGH刺激细胞株产生的cAMP值远高于出发菌株的GGH，表明STE13基因缺陷型GS115/D13菌株GGH生物活性较出发菌株生物活性有明显的提高。并针对上述结果及N端降阶的特性型设计了相关的地融合蛋白GGH类似物，进行了5种方法的延长修饰，即DAH-GGH、MSY-GGH、TFT-GGH、A-GGH和G-GGH，体外活性结果显示TFT-GGH，A-GGH与G-GGH均可以显著的促进cAMP的生成，且A-GGH与G-GGH的体外活性比母体蛋白GGH提高了10倍。小鼠体内糖耐量实验结果表明A-GGH与G-GGH还可以显著控制KM小鼠口服葡萄糖后血糖的增幅，而且类似物A-GGH在给药24 h后仍可以显著的发挥控制血糖增高的效果。综上所述，应用系统生物学原理结合反向代谢工程的手段研究长效人胰高血糖素样肽-1的降解问题。发表论文6篇，其中SCI 1篇，CSCD 5篇，申请专利1篇，达到了预期目标。