多环芳胺致癌的新型光致活性自由基的生成及DNA损伤机理研究

Due to their wide use and carcinogenesis, polyaromatic amines are well-known environment pollutants. N-hydroxy-acetylaminofluorene (N-OH-AAF) is the carcinogenic metabolite of 2-aminofluorene. It has been proposed that N-OH-AAF might be converted enzymatically to form nitrenium ion in vivo, which could attack DNA directly, forming two DNA adducts and inducing cancer. During our study on the reaction mechanism between polyhalogenated quinones and hydroxamic acids, we found, unexpectedly, that light-irradiation of N-OH-AAF could not only produce the highly-reactive hydroxyl radicals and DNA strand breakage, but also form new DNA adducts, suggesting that the DNA damage might be induced by light-activated N-OH-AAF via a new radical mechanism. In this project, we first plan to detect and identify the free radical intermediates produced by N-OH-AAF with light-irradiation by complementary application of ESR and HPLC-MS. Then to fully study the relationship between the radical intermediates and DNA damage, especially to characterize the chemical structures of new DNA adducts, hoping to find new biomarkers for DNA damage. We hope to elucidate the possible carcinogenic mechanism for light-activated N-OH-AAF, which may have great theoretical importance for further studies on the carcinogenic mechanism of polyaromatic amines.

多环芳胺由于其广泛的应用及公认的致癌性已成为众所周知的环境污染物。N-羟基-乙酰基氨基芴（N-OH-AAF）是2-氨基芴的致癌代谢中间产物。之前研究认为N-OH-AAF在体内酶的作用下代谢产生的氮正离子可直接进攻DNA，形成两种DNA加合物，最终引发癌症。在研究异羟肟酸与卤代苯醌的反应机理过程中，我们意外地发现光照N-OH-AAF不但能产生高活性的羟基自由基直接引起DNA链断裂，还可形成新型DNA加合物（无需酶催化），因而推测该光照反应可能通过自由基均裂机制发生。本项目拟从光照N-OH-AAF反应入手，采用电子顺磁共振、质谱等方法检测表征反应产生的羟基和其它活性自由基中间体;深入研究这些活性中间体对DNA导致的氧化和加合损伤的关系，特别是鉴定新型DNA加合物的结构，期望发现新的DNA损伤生物标志物。该研究将有助于阐明光照N-OH-AAF致癌的可能机制，为多环芳胺的致癌机理提供新的理论依据。

N-羟基-2-乙酰基氨基芴（N-OH-AAF）是典型的环境污染物硝基芴（NF）及多环芳胺的模型化合物2-乙酰氨基芴（AAF）的具有遗传毒性的代谢中间体。N-OH-AAF的致癌性先前主要归因于酶代谢激活后亲电性芳香氮正离子的产生，其可与生物大分子如DNA形成加合物。我们的研究发现，N-OH-AAF暴露于紫外线或阳光照射时也可产生与酶激活相同的DNA及蛋白质加合物。更有趣的是，在光激活N-OH-AAF体系中，除产生DNA加合物外，我们还检测到通过包括DNA链断裂及8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-oxodG）生成等氧化性DNA损伤。典型的羟基自由基（•OH）清除剂可抑制DNA氧化损伤。ESR二级自旋捕获和对苯二甲酸（TPA）荧光实验明确证实，N-OH-AAF的光解可导致高活性的•OH产生。化学降解DNA测序研究表明，N-OH-AAF的光激活会优先导致DNA鸟嘌呤位点损伤切割。通过双免疫荧光染色法我们发现成纤维细胞Balb/c-3T3细胞共同暴露于N-OH-AAF/UV辐射时，可在细胞体系中观察到明显8-oxodG和少量DNA双链断裂的形成。综上所述，我们提出在紫外光照射激活时，N-OH-AAF的N-O键均裂产生可造成DNA氧化和共价损伤的•OH和酰胺自由基。我们的研究首次报道具有基因毒性的芳香基异羟肟酸中间体可通过光活化路径导致•OH生成并可能造成DNA特异性碱基损伤。与经典的酶激活产生氮正离子得到机制相比，本研究提供了一种新的光活化产生自由基机制，这能更好地了解芳香胺致癌尤其是皮肤癌的分子机制。