四氯邻苯二酚与叠氮钠协同毒性分子机理

Tetrachlorocatechol (TCC) is one of the major genotoxic quinoid metabolites of the widely used wood preservative pentachlorophenol (PCP). NaN3 has been widely used as pesticide in agricultural industry. The residue of both compounds may coexist in the environment. During our study on the mechanism of toxicity of PCP quinoid metabolites, we found that NaN3 could markedly enhance TCC-induced cytotoxicity in a synergistic mode in E. coli, but its underlying molecular mechanism remained a puzzle. In this project, we plan to investigate the reaction between TCC and NaN3. First of all, the reaction products will be isolated, purified and identified by complementary application of various analytical methods. Secondly, the free radical intermediates will be detected by ESR spin trapping method and further identified by simulation and separation. Based on these data, we will propose a possible molecular mechanism for the reaction between TCC and NaN3. Then the reactive species responsible for synergistic toxicity will be identified based on the proposed mechanism and further confirmed by model biological molecules and cellular experiments. We hope to elucidate the underlying molecular mechanism for TCC/NaN3-induced synergistic toxicity, and verify whether this is a general mechanism for other polyhalogenated catechols.

四氯邻苯二酚（TCC）是广泛使用的木材保护剂五氯酚（PCP）的一种主要的具有遗传毒性的醌类代谢物。叠氮钠(NaN3)作为杀虫剂在农业生产中广泛使用。这两种化合物都可能会在环境中有一定浓度的残留，并很可能会同时存在环境中。然而，在研究PCP的醌类代谢中间物的毒性机制过程中，我们意外地发现NaN3能以协同的方式显著促进TCC所导致的对大肠杆菌的细胞毒性，然而其潜在的协同毒性分子机制仍不清楚。本项目拟从TCC/NaN3反应的本身入手，首先分离反应可得到的终产物，并分别进行结构鉴定。其次，采用电子顺磁共振等方法检测反应中产生的自由基中间体，并利用模拟，分离等方法加以确定。在此基础上，提出TCC/NaN3反应的可能机理，推测其产生协同毒性的活性分子，进而利用生物模型分子以及细胞实验加以验证。最后，希望阐明TCC/NaN3的完整反应机理，解释其协同毒性，并验证此机理是否也适用于其它的多卤代邻苯二酚。

我们最近已经报道了在细菌模型中叠氮钠能以协同的形式显著提高四氯邻苯二酚所致的细胞毒性。但是，其潜在的化学机理并不清楚。在本研究中，我们确定了叠氮钠与四氯邻苯二酚的主产物是独特的缩环产物2-(氯氰亚乙基)-5-氨基-4-氯-3(2H)-呋喃酮（CACF），副产物是两种醌类化合物。综合利用ESR, HPLC, FTICR/MS和N15-末端取代的叠氮钠，我们检测到并表征了两个主要的自由基中间体，它们是叠氮基取代的多氯-O-半醌自由基。基于这些数据，我们提出了叠氮钠与四氯邻苯二酚反应的新型分子机制：N3－ 会首先进攻由四氯邻苯二酚自动氧化生成的四氯-O-半醌自由基，形成第一个不稳定的4-叠氮基-3,5,6-三氯-O-半醌自由基。该自由基进一步被另一分子的N3－进攻生成反应活性更高的第二种4,5-二叠氮基-3,6-二氯-O-半醌自由基中间体。大部分的该自由基中间体可能会发生非同寻常的两性离子重排形成低毒的缩环产物CACF，少部分的二叠氮自由基会进一步脱氮生成毒性更高的一叠氮一氨基取代的邻苯醌。形成这种高毒性的邻苯醌化合物产率正好与TCC/NaN3产生协同毒性的特殊比例完成一致。此研究首次检测并鉴定了一种独特的两性离子重排环缩合产物和两种非同寻常的叠氮基-O-半醌自由基。这两种活性叠氮基-O-半醌自由基的形成可能是四氯邻苯二酚和叠氮钠产生协同毒性的原因之一。该反应机理适用于所有4，5位被卤代的邻苯二酚与叠氮钠的反应。本研究将对后续研究多卤代芳香污染物与叠氮钠的环境，生物，化学行为提供进一步的理论指导。