益肾填精法对发育期大鼠惊厥性脑损伤神经保护作用的自噬调控机制研究

Autophagy is closely correlated with neuronal injury of epilepsy.Based on the earlier research confirmed that Rongchang capsule with the enriching kidney essence method has exact antiepileptic effect and protection neurons, the hypothesis that Rongchang capsule play antiepileptic effect and neural protection role by regulating neurons autophagy was put forward. This study is intended to take autophagosome as key point;mainly based on convulsions stimuli neuronal injury,autophagy,signaling pathway and activity regulation;using cerebrospinal fluid pharmacology of Chinese materiamedica method,primary cultured neurons from hippocampus of neonate rats with recurrent epileptiform discharges induced by magnesium-free-treatment.Divided into normal group, model group,TCM cerebrospinal fluid group (Rongchang capsule) and 3-Methyladenine(3-MA) control group. At different time (1.5h, 3h, 6h, 12h, 24h, 72h and 14d) after Mg2+-free treatment observing:(1) morphology changes of damage neurons and autophagy body change; (2) the changes of autophagy-associated genes and proteins (Beclin1, vps34 Bcl-2, and Atg5, LC3，Cathepsin B) expression; (3) the changes of autophagy signal regulation pathways-related genes and proteins (p110 alpha, p-AMPK, Akt/mTOR, p-Akt/mTOR) expression. Expound the autophagy regulation mechanism of the enriching kidney essence method with antiepileptic and neuroprotective effect so as to provide experiment evidence for clinic.

自噬与癫痫发作后神经元损伤密切相关。在前期研究证实以益肾填精法为主的茸菖胶囊抗痫增智疗效肯定、保护神经元优势突出的基础上，提出"茸菖胶囊可通过调控神经元自噬发挥抗癫痫及神经保护作用"假说。本研究以海马神经元自噬为切入点，以惊厥刺激、自噬及其活性调控通路激活、神经元损害为主线，采用中药脑脊液药理学技术，以原代培养的胎鼠海马神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型，设正常组、模型组、中药脑脊液组和3-MA对照组。在无镁损害后1.5、3、12、24、72h及第6天检测：①神经元损伤及其自噬体的形态学改变；②自噬相关基因与蛋白（Beclin1、vps34、Bcl-2、Atg5、LC3、Cathepsin B）的表达；③自噬调控信号通路相关基因与蛋白（p110α、p- AMPK、Akt/mTOR、p-Akt/mTOR）表达。阐明益肾填精法抗痫和神经保护作用的自噬调控机制，为临床应用提供实验依据。

基于前期研究证实以益肾填精法为主的茸菖胶囊抗痫增智疗效肯定、保护神经元优势突出的基础上，本研究以海马神经元自噬为切入点，以惊厥刺激、自噬及其活性调控通路激活、神经元损害为主线，采用中药脑脊液药理学技术，将体外培养第9天的海马神经元换液，随机将其分为正常组（正常细胞外液）、模型组（无镁细胞外液）、对照组（无镁+3-MA）、中药脑脊液组（无镁+低、中、高茸菖胶囊）。分别加入含相应不同浓度的中药脑脊液和3-MA培养液，取处理后6h、12h、24h、72h的神经元检测各组神经元的形态及凋亡情况、损伤程度，神经元自噬体超微结构、神经元内自噬泡和自噬溶酶体数量，自噬相关基因与蛋白（Beclin1、vps34、Bcl-2、Atg5、LC3、Cathepsin B）的表达和自噬调控信号通路相关基因与蛋白（p110α、p- AMPK、Akt/mTOR、p-Akt/mTOR）表达。.结果显示：①茸菖胶囊能降低无镁诱导的癫痫细胞模型海马神经元LDH漏出量，维持细胞膜的完整性及线粒体功能，提高细胞活力并降低海马神经元凋亡率，起到保护海马神经元的作用。②茸菖胶囊提高对无镁诱导癫痫细胞模型神经元的活性，抑制海马神经元的凋亡，其神经保护作用可能与调控神经元自噬有关。③茸菖胶囊可通过减少自噬体的过度形成，从而有效减轻无镁诱导癫痫细胞模型神经元的病理损伤。且茸菖胶囊（低、中、高）剂量组对海马神经元的保护作用随其浓度升高而显著，呈现浓度依耐趋势。④茸菖胶囊可通过减少自噬泡和自噬溶酶体数量，有浓度依赖趋势。同浓度不同时间点细胞自噬泡和自噬溶酶体数量表达结果显示72h时最少，细胞活力最高。⑤茸菖胶囊通过影响Beclin1 mRNA、Beclin1蛋白等表达水平分别在自噬体的启动、形成、融合阶段调控自噬体的形成，且呈现浓度依赖趋势，对自噬体融合阶段的影响有时间依赖趋势，72h效果最为显著。⑥茸菖胶囊通过影响mTOR自噬信号通路p-AMPK mRNA表达水平在调控自噬信号传导途径中发挥作用，调控自噬体的形成，且72h效果最为显著，呈现浓度依赖趋势。