中药复方对发育期大鼠惊厥性脑损伤神经保护作用的分子机制研究

癫痫形成和发展与神经损害密切相关，氧化应激损伤线粒体，进而激活细胞凋亡通路是癫痫后神经元脱失的重要机制，中药复方可通过该通路发挥抗癫痫作用。本研究拟以海马线粒体为切入点，以线粒体氧化应激损伤、钙稳态失调、细胞凋亡信号通路激活和神经元损害为主线，采用中药脑脊液药理学技术，以原代培养的胎鼠海马神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型,根据对培养6d海马神经元的不同处理分为正常组、模型组、中药脑脊液组（茸菖胶囊、抗痫胶囊、熄风胶囊）和MK-801对照组。在无镁损害后6h，24h，72h及第6天检测分析：①海马神经元离子通道功能变化；②神经元损伤的形态学改变；③线粒体氧化损伤、ATP水平与线粒体酶活性；④线粒体ROS、MPP和mtDNA氧化损伤；⑤[Ca2+]i变化；⑥线粒体凋亡信号通路相关蛋白表达。以阐明有效中药复方抗癫痫和神经保护作用的靶点和线粒体调节机制的不同环节，为其临床应用提供实验依据。

基于前期研究基础和认识，本研究以海马线粒体为切入点，采用中药脑脊液药理学技术，以原代培养的胎鼠海马神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型，对培养12d海马神经元的不同处理分为正常组、模型组、中药脑脊液组（茸菖胶囊、抗痫胶囊、熄风胶囊）和MK-801对照组。在无镁培养后6h，24h，72h后进行以下指标检测分析:（1）膜片钳检测海马神经元放电情况；（2）通过MTT法和LDH测定了解细胞增殖和细胞凋亡方面；（3）观察中药复方对海马神经元NMDA受体、离子通道及相关调控蛋白的作用；（4）通过检测线粒体膜电位、氧化应激指标、细胞凋亡相关调控基因探索中药复方对线粒体氧化损伤过程的作用。结果显示：（1）三种中药复方发挥神经保护作用的机制包括抑制癫痫模型细胞放电（即减少惊厥发生次数、减轻发作程度）。其中以熄风组作用最强，茸菖组次之，抗痫组最弱。通过缩短衰减时程、降低细胞内游离钙浓度、调节电压依赖性钠、钾电流通道、调控NMDA受体相关蛋白PSD95、BDNF、NR2A的表达应该是熄风胶囊等中药复方发挥神经保护作用的重要机制。（2）三种中药复方均具有抗氧化应激损伤和抗细胞凋亡的作用，其中以茸菖组最强，抗痫组次之，熄风组最弱。通过升高线粒体膜电位、降低ROS、提高线粒体ATP水平，调控氧化损伤过程中Bcl-2、caspase-3等关键基因应该是茸菖胶囊等中药复方发挥神经保护作用的重要机制。（3）三种中药复方组方原则不同，作用特点不同。以息风止痉药物为主，兼有补肾药物的熄风胶囊具有很好的抑制细胞放电的作用。以补肾药物为主，兼有健脾化痰药物的茸菖胶囊具有很好的抗氧化应激损伤和细胞凋亡的作用。该课题历时三年完成，发表期刊论文6篇（含已录用1篇），会议论文1篇，培养博士后1人，博士2人，硕士2人。