CXCL12-CXCR4调控背根神经节交感神经增生的机制研究

Neuropathic pain (NPP) is one of the common intractable clinical problems which remarkably affects the life quality of patients. According to recent studies and our experience of clinical treatment for NPP, the change of plasticity of the sympathetic nerves is a critical factor for NPP development. However the mechanism is unclear. The activation of glia cells and chemokines play a key role in the development of NPP after nerve injury. The pilot experiment showed that inhibition of activation of satellite glia cells(SGC) could alleviate basket sprouting of sympathetic nerves in dorsal root ganglia(DRG) and neuropathic pain related behavior. Chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 may play critical roles in this process. Based on this speculation, animal spinal nerve ligation (SNL) model and cells primary culture would be administrated in this project to inhibit SGC and sympathetic nerve activity respectively, RNA interfering technology in vivo and transgenic techniques were used to observe how SGC modulates basket sprouting of sympathetic nerves in DRG and neuropathic pain behavior through CXCL12-CXCR4 signal pathway. Relevant mechanisms were discussed at the same time. These results may provide a novel strategy for NPP treatment.

神经病理性疼痛（NPP）是临床常见顽疾之一，疼痛程度剧烈，治疗效果欠佳，严重影响患者的生存质量。各种研究和我们前期临床治疗NPP的经验提示交感神经的可塑性改变是导致NPP疼痛的重要原因之一，在神经损伤后，胶质细胞的激活和趋化素的活化在NPP中起到重要的作用，但是具体机制不明。我们预实验的结果提示抑制卫星胶质细胞（SGC）的激活可减缓背根神经节（DRG）中交感神经的篮状增生和神经病理性痛行为，趋化素CXCL12及其受体CXCR4在这一过程中可能起到关键作用。基于此，本项目通过建立实验动物SNL模型和体外原代细胞培养，分别抑制SGC或者交感神经活性，结合在体RNA干扰和转基因等技术，观察SGC是如何通过CXCL12-CXCR4的改变影响DRG中交感神经纤维的篮状增生和神经病理性痛行为改变，并探讨相关机制。为NPP治疗提供一个新的靶点和理论依据。

探究CXCR4在外周神经损伤引起的神经病理性疼痛发生发展中的作用及其可能的机制。在体实验部分，采用雄性SD大鼠，随机分为3组：假手术组（Sham组），对照组（SNI组）和治疗组（AMD组）。采用保留性坐骨神经损伤术（L5 spinal nerve ligation, SNL）建立疼痛模型，AMD组鞘内连续注射CXCR4特异性拮抗剂AMD3100（1ug/10ul，每天一次，连续两周），Sham组和SNI组予生理盐水，采用Von-Frey细丝测量大鼠患肢机械刺激缩足阈（PWT）。于术后第14天、21天取大鼠L5脊髓及L5背根神经节（DRG）采用免疫荧光及western blotting技术检测脊髓CXCR4、甘氨酸受体α3亚单位（GlyRα3）及蛋白激酶p-ERK的表达。离体实验部分，采用极低密度培养原代SD大鼠交感神经元，免疫荧光染色法检测CXCR4受体与酪氨酸羟化酶（交感神经元标记物，TH）表达情况，应用激光共聚焦显微镜和荧光显微镜进行共定位或计数。外源性CXCL12干预极低密度培养的交感神经元，观察对其轴突生长的影响，对照组加入等量PBS，两组培养12小时后对全部神经元进行活细胞荧光染色，并对神经元逐一拍照处理，测量每细胞的轴突总长度和轴突分支点数量，并对神经元进行同心圆法（Sholl Analysis）分析。结果显示，与Sham组相比，SNI组大鼠PWT值术后明显降低（P＜0.01），脊髓和DRG中CXCR4表达增高（P＜0.01），同时伴有脊髓背角GlyRα3表达下调（P＜0.01）。鞘内连续注射AMD3100可显著提高大鼠PWT（P＜0.05），抑制CXCR4的活化，并上调脊髓背角GlyRα3表达（P＜0.01）。体外实验结果显示，CXCR4主要定位于原代培养的交感神经元胞体部位，少量表达于轴突与生长锥，细胞计数共定位率为99.72%。使用外源性CXCL12干预会使培养的交感神经元的轴突复杂度增加（P＜0.001）和分支点数量增加（P＜0.05），但对轴突总长度的影响无统计学意义（P＞0.05）。只对靠近胞体的第一级轴突进行Sholl分析，第一级轴突复杂度较对照组明显下降（P＜0.0001）。结论： CXCL12-CXCR4可能通过调控中枢敏化和交感神经元的芽生来参与和调控神经病理性疼痛的发展。