水稻粒长QTL qGL3.2的克隆及其功能研究

本研究以千粒重达71.1克的大粒粳稻资源N411与籼稻品种93-11、小粒籼稻品系05-643等杂交、回交，构建不同背景的粒长主效QTL qGL3.2近等基因系。在此基础上采用图位克隆策略，精细定位和克隆qGL3.2，构建qGL3.2的植物转化载体，进行转基因功能验证。进一步分析近等基因系和遗传转化后代的组织细胞学特性，探明其对组织细胞的作用；通过对等位基因核酸和蛋白水平的差异分析、基因时空表达分析和原位杂交，结合生物信息学信息，阐述基因的分子生物学特征和分子作用机理；分析不同地理来源的大、小粒种质的qGL3.2等位基因多态性，结合种质的分子标记信息，研究qGL3.2基因起源与进化；利用93-11等推广品种为背景的近等基因系和转基因后代，分析粒重结构、个体与群体产量结构变化，评价qGL3.2基因生产利用价值。

籽粒是水稻重要产量构成因素，其形状又影响外观品质，因而水稻粒形与粒重研究具有重要理论和实践意义。大粒粳稻N411含有多个粒重增效位点，其中第3染色体qGL3.2（后定名为qGL3）同时控制粒长、粒宽、粒重和穗长等性状。利用93-11为背景的回交后代分离家系将qGL3定位在InDel标记XJ39与XJ26之间的46.6kb 区间内。.目的区间预测有5个ORFs，其中LOC_Os03g44500是唯一在亲本间存在差异ORF，它编码一个包含两个Kelch结构域的丝氨酸/苏氨酸磷酸（酯）酶（OsPPKL1）。OsPPKL1N411的cDNA 序列有4处单核苷酸变异。SNP1是C转变为 A，导致编码蛋白364位的天冬氨酸转变成了谷氨酸；SNP2是C转变成T，导致499位组氨酸转变成了酪氨酸；另两处SNPs 均为同义突变。OsPPKL1N411的突变位点SNP1发生在第二个Kelch结构域的一个保守的AVLDT区域，突变位点SNP2位于一个非完全保守区域。在核心种质分析qGL3基因序列，鉴定出25个多态性位点。只有突变SNP1与粒长具有显著关联，为一个稀有变异。.OsPPKL1在幼穗中表达随着发育进程而逐渐增加，OsPPKL1启动子GUS活性分析结果相似。OsPPKL1定位于细胞质和细胞核中，OsPPKL1N411的突变并没有改变其亚细胞定位。转基因过表达OsPPKL193-11引起中花11籽粒变短，而过表达OsPPKL1N411没有引起籽粒变化，说明OsPPKL193-11具有负调控功能。T-DNA插入突变体osppkl1籽粒变长。OsPPKL193-11的Kelch功能域过表达转基因引起籽粒变短，而过表达PP2A结构域不会引起籽粒变化，说明Kelch是负调控功能的关键结构域。qgl3与gs3存在部分加性效应。qGL3和GS3调控的基因既有独立的又有部分重叠的。qgl3加快颖壳细胞的纵向分裂速度而引起籽粒变长、增加穗长、加快子房伸长和加速籽粒灌浆。93-11 NIL-qgl3及其配置的两系杂交稻均能显著增产。.水稻中OsPPKL1存在两个同源基因。OsPPKL3定位于细胞质和细胞核，过表达引起水稻籽粒变短，敲除突变形成较长的籽粒，也是一个负调控的功能基因；而OsPPKL2位于胞质中，过表达反而引起籽粒变长，敲除突变使籽粒变短，因此OsPPKL2在籽粒发育中发挥正调控的功能。