水稻粒长主效基因GL6的克隆和功能解析

Abstract: grain shape has an important effect on rice yield and quality. Isolation of more genes for grain shape will help to understand the mechanism on grain shape formation. We screened a mutant from the MH63 mutant library that was induced by EMS. The mutant has a long grain with 3.7 mm longer than the wild type Minghui 63. A new grain length gene GL6 was identified using MutMap method. Complementation test in the mutant background showed that some positive transgenic plants show short grains, which indicated the identity of GL6. It encodes a protein kinase. On the basis mentioned above, we designed the project. We complete the cloning of GL6. GL6 will be characterized by RNA in situ hybrid in young panicle and pattern of temporal and spatial expression. We will investigate the transcriptional regulation between GL6 and genes involved in cell cycle and known grain shape genes. We will construct a cDNA library for yeast two-hybrid screening and identify the proteins interacting with GL6, and the substrate of GL6 . GL6 will be expressed in vitro to test its enzymatic activity and measure its phosphorylation ability to its substrate. Finally we will elucidate the molecular mechanism of GL6 on grain length. In addition, we will discover the natural variants of GL6 by re-sequencing a germplasm collection and suggest favorable alleles for breeders. The implementation of this project will enrich the regulatory network for grain length and gene resources for grain shape improvement.

摘要：粒形对水稻产量和品质具有重要的影响，分离更多的粒形基因将有助于更好理解水稻粒形形成的机制。我们从EMS诱变的MH63的突变体库中筛选出一个比野生型长3.7 mm的极端长粒突变体，通过MutMap方法定位到一个新的粒长基因GL6，GL6编码一种蛋白激酶。在突变体中遗传互补了GL6，在T0代单株中观察到粒长显著变短的阳性单株。在此基础上，我们将完善GL6的克隆工作；利用RNA原位杂交和实时定量PCR技术明确GL6自身特征；在转录水平分析GL6与细胞周期基因和已知粒形基因的调控关系；构建酵母双杂交文库，筛选与GL6互作蛋白，鉴定GL6的底物；体外表达GL6测定其酶活，分析其对底物磷酸化能力，从而解析GL6调控粒长的分子机制。利用种质资源群体重测序GL6，挖掘优良自然变异，为水稻粒形改良提供优良等位基因。本项目的实施将丰富水稻粒形调控机制和粒形改良基因资源。

粒长是水稻的重要农艺性状，直接影响了产量和品质。近十多年来，水稻粒长基因的克隆和分子机理的研究取得了较大的进展，而发掘更多粒长基因不仅具有生物学意义，同时也具有重要的农业生产和育种实践意义。同时解析这些基因调控粒长的分子机制可以丰富粒长发育的分子途径，并可更好的指导分子设计育种。前期在明恢63的EMS诱变突变体库中筛选到一个比明恢63更长的突变体材料，命名为grain length 6(gl6)。本项目希望通过对gl6突变体基因的克隆，丰富粒长的调控网络。.通过对gl6的农艺性状考察发现，与野生型相比，gl6可以显著增加粒长，而显著减少穗粒数以及降低结实率和产量。I-KI染色表明gl6的花粉育性较野生型显著降低。运用MutMap的分析方法，把gl6在第5染色体上，编码拟南芥MKP1同源蛋白OsMKP1。该基因的一个碱基发生了非同义突变，导致编码的氨基酸发生了改变。而互补分析发现,明恢63的等位基因GL6可以完全互补gl6的突变表型。而中花11背景下CRISPR/Cas9敲除表现出类似gl6突变体的大粒、育性下降和穗粒数减少的表型；过量表达GL6表现出粒形短圆，穗型直立。同时，RNAi抑制GL6表现出粒长与GL6表达量负相关。核苷酸多样性分析发现，GL6编码区的π值明显低于全基因组水平和两侧20-kb区段。而启动子区域的变异可以分为11种单倍型。将11种单倍型的启动子分别连接萤光素酶并转化原生质体，发现不同的单倍型之间的荧光素酶活性存在显著差异。将种质群体按照GS3有无功能分成两组，组内每个单倍型的平均粒长与启动子的驱动能力呈现负相关，猜测在自然群体当中可能存在不同的等位型可以在一定程度以内调控水稻的粒形。.本项目的研究鉴定到一个新的粒长基因GL6，通过对GL6的克隆以及相关分析发现，GL6不仅仅影响粒长，而且对花粉育性和穗型也具有重要的调控作用。尽管GL6有如此大的粒长效应，但是为什么在近30年的水稻重要农艺性状遗传研究中未见相关报道，可能与GL6对水稻相关性状的调控非常保守，不能突变，而相关转基因材料和自然变异的分析也证明了这一点。因此，虽然gl6能增加粒长，但是结实率和产量的降低限制了其在水稻粒长性状遗传改良过程中的应用。