白菜花粉内壁发育的“eTM–miR160–ARF17–基因X”调控通路研究

Intine, the inner layer of the pollen wall, is important for pollen actions such as germination and pollen tube growth. Defective intine contributes to male sterility. However, the molecular mechanism underlying intine formation is still unknown. In our previous study, two lncRNAs were found to be involved in intine formation by regulating the expression of miR160 and its target ARF genes via endogenous target mimicry (eTM) mechanism in Brassica rapa. Thus, an ‘eTM-miR160-ARF17-gene X’ pathway which might regulate intine formation was presumed. In this study, we aim to expand our understanding of this pathway in intine formation regulation network, by identifying the unknown X gene or genes, the specific sequence motifs required for effective eTM function, and the regulators determining the eTMs transcription. These studies will do a great favor on better understanding the molecular mechanism of intine formation, as well as the function of non-coding RNAs in gene regulatory network during pollen development, and finally help us to get more knowledge about the male sterility and fertility control in crops.

花粉内壁作为花粉壁的主要组成部分在花粉功能发挥中具有重要的作用，其异常发育常导致雄性不育，但关于内壁发育的分子调控机制尚不清楚。本项目围绕前期研究提出的白菜花粉内壁发育“eTM–miR160–ARF17–基因X”调控通路，鉴于下游基因未知及上游两个eTM在工作效率和组织表达特异性上存在差异，拟通过ChIP-Seq、EMSA结合基因功能分析，鉴定下游基因X；通过构建eTM侧翼序列不同截断突变体和定点突变体，在烟草及白菜中进行体外、内研究，确定eTM工作效率的决定因子；通过检测eTM启动子序列DNA甲基化水平在不同组织中的变化、寻找与之结合的转录因子，探寻eTM本身转录的调节机制，以此梳理并拓展“eTM–miR160–ARF17–基因X”调控通路，最终为阐明花粉内壁发育的分子机理，解析非编码RNA在花粉发育基因调控网络中的作用，推进对作物雄性不育机制的理解及重要功能基因的利用提供理论基础。

围绕前期研究提出的白菜“eTM–miR160–ARF17–基因X”调控通路，鉴于下游基因未知及两个eTM在工作效率和组织表达特异性上存在差异的原因未明问题，本项目通过ChIP-Seq技术结合特异位点分析，筛选到ARF17下游靶基因CalS5；通过在拟南芥中表达白菜两个eTM，发现遗传背景对其作用的发挥存在重要影响，验证了白菜基因组新产生的bra-eTM160-2比物种保守的bra-eTM160-1具有更高的工作效率；通过在拟南芥中表达白菜两个eTM共6个不同侧翼序列互换截断体，确定了影响eTM工作效率的区域，创新性地发现eTM的二级结构是影响其工作效率的重要因子，并在白菜中进行同源表达验证了这一假设；通过对启动子序列的分析，初步发现不同响应元件的存在是影响eTM自身表达及功能发挥的原因；通过转录组测序等手段进一步构建了包括花粉壁发育在内的白菜花粉/花药发育过程非编码RNA参与的基因表达互作网络；通过烟草瞬时表达及在拟南芥、白菜体内表达等实验，验证了bra-miR5718HG、bra-eTM156等lncRNA的生物学功能，并研究了它们与miRNA的关系，发现eTM全长序列对于其功能的发挥至关重要。研究结果梳理并拓展了“eTM–miR160–ARF17–基因X”调控通路，为修正现有或开发新的eTM预测方法提供了思路和依据，为认识白菜花粉/花药发育基因表达调控、eTM作用机制的复杂性和演化规律提供了新的证据，为今后eTM及其它非编码RNA的功能和作用机制研究提供了借鉴。