米曲霉麦角甾醇合成关键基因功能鉴定和调控机理研究

Ergosterol is an important component of fungal cell membrane. It is not only essential for the growth and stress adaptation of fungi, but also has important economic value as it is the precursor of vitamin D2 and other drugs. Our physiological experiments showed that ergosterol is involved in the regulation of growth and stress adaptation of Aspergillus oryzae. Further, bioinformatics analysis revealed that the gene of sterol biosynthesis in Aspergillus oryzae genome was more complex than that of yeast. Therefore, this research focuses on the biosynthesis and regulation mechanism of ergosterol in Aspergillus oryzae. This study purified the ergosterol biosynthesis enzymes via prokaryotic expression to identify their biochemical functions through substrate binding ability and enzyme activity detection, to establish their genetic functions through heterologous complementation of yeast mutants, and the functional relationship of multi copy genes was determined by the expression pattern and subcellular localization method. Meanwhile, we also analyzed the gene expression profile changes of Aspergillus oryzae by exogenous ergosterol and ergosterol biosynthesis inhibitor treatment. In addition, this research also takes advantage of activation tagging technique to study the functional genomics of Aspergillus oryzae in order to find the key genes responsible for the regulation of ergosterol biosynthesis in Aspergillus oryzae. By these experiments, it aims to provide new ideas for enhancing the stress tolerance of Aspergillus oryzae and improving the production of ergosterol by Aspergillus oryzae fermentation. Besides, the activation tagged mutant library can also be used as materials of excellent strain selection and functional genomics research.

麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分，其不仅参与调控真菌生长和胁迫响应而且还是维生素D2和多种药物的前体，具有重要经济价值。通过生理实验，我们发现麦角甾醇参与调控米曲霉生长和胁迫响应，生物信息学分析显示米曲霉基因组中麦角甾醇合成基因比酵母复杂。因此，本课题对米曲霉麦角甾醇合成和调控机理进行研究。采用原核表达纯化蛋白、检测酶和底物结合能力、酶活性测定和酵母异源互补等生化和遗传学方法对这些酶的功能进行鉴定；结合表达模式和亚细胞定位观察来确定多拷贝基因间的功能关系。同时，利用转录组学分析麦角甾醇对米曲霉基因表达谱的影响。另外，本研究还巧妙地将激活标签技术应用到米曲霉功能基因研究，以期通过激活标签突变体筛选找到调控米曲霉麦角甾醇合成的关键基因。通过这些研究为改良菌种，增强抗逆能力和提高米曲霉发酵生产麦角甾醇的产量提供新思路，所构建的激活标签突变体库也可以为后期优良菌株选育和功能基因研究提供材料。

麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分，其不仅在医药和饲料营养方面有着十分重要的应用，而且对于工业微生物发酵过程中菌株生长，胁迫适应等方面具有十分重要的功能。然而，作为食品酿造行业中具有着十分重要应用的米曲霉，目前并没有任何有关麦角甾醇合成和调控的相关研究报道。本研究的主要目的在鉴定米曲霉麦角甾醇合成基因功能，揭示米曲霉麦角甾醇合成调控机理，为提高以米曲霉为菌种发酵生产麦角甾醇产量奠定理论基础。首先，通过以GFP和DsRed为报告基因，建立了单个和2个基因同时转化的农杆菌介导转基因体系，为后续研究奠定基础。真菌中麦角甾醇合成过程涉及21个合成酶，在酵母中由22个基因编码。通过生物信息学分析发现，米曲霉中涉及到50个编码基因，说明米曲霉中麦角甾醇合成较其它物种更为复杂。目前已经将所有基因都已经克隆出来，通过原核表达以及酵母互补对其功能进行鉴定；同时将这些基因在米曲霉转基因和基因敲除研究这些基因在米曲霉中的功能。本研究已经完成了全部基因的过表达和部分基因编码蛋白质的亚细胞定位确定。其中，鉴定到AoErg19基因对麦角甾醇合成十分必需，无论是过表达还是敲降均引起麦角甾醇合成下降，同时还影响了脂肪酸代谢。我们还发现该蛋白的亚细胞定位与其他物种不一致，是定位在液泡中。此外，基于该项目我们构建了米曲霉激活标签突变体库，筛选到很多有表型的突变体。例如，鉴定到一个多磷酸肌醇-5-磷酸酶 (5PTase) 过表达米曲霉突变体，该突变体对不同碳源十分敏感型。该项目资助下以第一作者或者通讯作者发表SCI论文4篇，参与发表论文7篇，申请专利2项，培养硕士研究生2名。通过这些研究为进一步研究米曲霉甾醇合成和代谢调控机理奠定基础，进而为改良米曲霉菌种活力，提高米曲霉发酵生产麦角甾醇的产量，增强米曲霉抗逆境能力和代谢活力提供新思路。