Rock2 siRNA对自发性高血压大鼠勃起功能障碍的影响

RhoA/Rho激酶-钙离子敏感途径对于保持海绵体平滑肌收缩张力、维持阴茎萎软状态至关重要，RhoA/Rho激酶抑制剂注入大鼠阴茎海绵体，可使血管舒张，海绵体内压增高，且其途径是非NO依赖性血管舒张途径，Rho激酶还可增强NO的作用。因此，抑制Rho激酶可以促进血管平滑肌舒张和阴茎勃起。本项目建立以lentivirus为载体的Rho激酶亚型(Rock 2)基因特异的RNAi系统，并利用这一系统研究特异性siRNA抑制Rock 2基因表达，以及对海绵体平滑肌细胞的影响；阐明ED发生过程中起主要作用Rho激酶亚型种类，为深入了解ED发生的分子机制奠定理论基础；研究该方法在阴茎勃起障碍（ED）实验治疗中的效果及安全性。该方法具有基因特异性，因此预计能创立一种更为简便、有效并且安全的ED治疗新方法，对分子生物学、男科学的基础及临床研究具有重要意义。

尽管阴茎勃起是多因素综合造成的，本项目在国内外相关研究的基础上，选择影响阴茎海绵体平滑肌收缩功能的关键信号分子作为主攻目标，建立以lentivirus为载体的Rho激酶亚型（RocK 2）特异的siRNA系统，利用这一系统研究特异性siRNA抑制Rho激酶基因表达，以及对海绵体平滑肌细胞的影响，研究该方法在阴茎勃起障碍（ED）治疗中的效果及安全性。本项目以SHR和WKY大鼠为实验对象，首先设计了针对大鼠RocK 2基因序列的4个siRNA片段，针对SHR大鼠ROCK2mRNA序列(GenBank Accession Number:NM_013022.1)，设计并合成靶向第643、1397、2287、3816位序列的ROCK2-shRNA。培养纯化SHR阴茎海绵体平滑肌细胞至第5代。构建寡核苷酸的合成和慢病毒载体、慢病毒包装细胞，将分别携带这些片段的慢病毒载体转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞后，筛选出携带有RocK 2基因最大抑制作用的siRNA片段的慢病毒载体，然后使用12周龄的SHR及WKY雄性大鼠，分为SHR siRNA组、SHR GFP组、SHR正常对照组、WKY siRNA组、WKY GFP组、WKY正常对照组。分别注射ROCK 2特异的siRNA、GFP和生理盐水。一周后，检测大鼠的ICP/MAP、观察阴茎海绵体的荧光表达、阴茎海绵体组织的NOS活性、通过免疫组化和western blot检测ROCK 2在阴茎海绵体内的表达。结果发现SHR siRNA组的ICP/MAP较SHR GFP组、SHR正常对照组显著增高（P<0.05）。SHR siRNA组、SHR GFP组、WKY siRNA组和WKY GFP组海绵体组织内的荧光均表达明显，而SHR和WKY的正常对照组海绵体组织内未见荧光。免疫组化检测ROCK 2主要表达在大鼠的血管内皮细胞和海绵体平滑肌细胞的胞浆，western blot检测ROCK 2蛋白的表达，SHR siRNA组显著低于SHR GFP组和SHR正常对照组（P<0.05），WKY siRNA组也显著低于WKY GFP组和WKY正常对照组（P<0.05），SHR 正常对照组显著高于WKY正常对照组（P<0.05）。该载体能有效抑制SHR阴茎海绵体组织表达RocK 2蛋白、上调eNOS和p-eNOS，显著增加其ICP/MAP，表明该siRNA片