制备两种分别具有细胞膜重建和体内抗凝功能的血栓调节蛋白衍生物

Thrombomodulin (TM) is a transmembrane protein mainly expressed by endothelial cells, and it converts the role of thrombin from procoagulant into anticoagulant. TM contains five domains with different biological functions, in which the forth to sixth EGF-like (epidermal growth factor–like structures) region (TM456) is the minimum functional unit responsible for anticoagulant activity, and thus serves as a potential candidate of antithrombotic agent. However, the half-life of recombinant TM456 is much shorter than the whole recombinant TM that is probably due to the lack of glycosylation domain. The proposal aims at the bifunctionalization of the TM456 derivatives with glycosaminoglycan /glycopolymer, PEG, phospholipid and long-circulating liposome by two bioorthogonal reactions (Copper Free Click Chemistry and SortaseA Mediated Ligation), and two kinds of TM mimics will be obtained. One TM456 conjugate with enhanced anticoagulant activity and pharmacokinetic properties mimics the native soluble TM in blood circulation. The other conjugate with glycosaminoglycan and phospholipid mimics the intact TM on endothelial cell surface, and it can insert into and reconstitute the injured cell membrane by the hydrophobicity of phospholipid. At last, rats and vascular endothelial cells will be used as models to test the properties of the two TM456 conjugates and the optimized modification strategies will be screened.

血栓调节蛋白(Thrombomodulin, TM)是主要表达于内皮细胞表面的跨膜蛋白，可将凝血酶由促凝血剂转变为抗凝血剂。TM分子的五个结构域分别具有不同的功能，其EGF样结构域中的第4至6段(TM456)是其抗凝活性的最小单位，具有开发为新型抗凝剂的潜力，然而缺少糖基化修饰的重组TM456在血液内的半衰期极短，此缺点使其不适合作为药物使用。本项目计划使用合成的多种功能基团，通过使用两种生物正交反应对TM456进行双重功能化，可分别得到两类偶联产物。一种与血液循环内的可溶性TM类似，具有增强的抗凝活性和药代动力学性质。而另一种偶联产物则通过脂化模拟细胞表面的完整TM，磷脂基团的疏水性可使TM456嵌入到受损细胞膜表面，达到补充其表面TM及活性的目的。最后，本项目将分别使用大鼠和血管内皮细胞作为模型对以上两类偶联产物的体外和体内活性进行考察，筛选出最优化的蛋白修饰方案。

血栓调节蛋白(Thrombomodulin, TM)是主要表达于内皮细胞表面的跨膜蛋白，可将凝血酶由促凝血剂转变为抗凝血剂。TM分子的五个结构域分别具有不同的功能，其EGF样结构域中的第4至6段(TM456)是其抗凝活性的最小单位，具有开发为新型抗凝药物的潜力。然而，重组TM456仅含有123个氨基酸，较小的分子粒径导致其血浆半衰期仅有6-9分钟，这一特性严重制约了其在临床应用中的效果。研究表明通过将TM456与聚乙二醇、脂质体等生物大分子进行偶联可有效增加其分子粒径，达到增加其生物有效期的目的。在本项目中，首先通过氨基酸置换的方法表达了带有单一叠氮基团的重组azido-TM456，随后通过无铜催化的点击化学将azido-TM456与血栓靶向肽（CREKA）功能化的纳米胶束偶联，制备得到双功能化的纳米胶束TM456-CREKA-micelle。对偶联产物活化人蛋白C的能力进行分析，可知TM456的凝血酶辅因子活性几乎不受偶联反应的影响。对TM456-CREKA-micelle进行动态光散射分析可知其分子粒径约为22nm，远大于肾小球滤孔7nm的直径，表明与纳米胶束的偶联有效增加了TM456的分子粒径，同时进行的小鼠体内实验也进一步证实与胶束的偶联可将TM456的血浆半衰期提升六倍以上；此外，通过构建小鼠急性肺栓塞模型对胶束的血栓靶向性进行了分析，western blot对TM456在主要器官的分布情况进行分析发现，在胶束中导入CREKA五肽可有效增加TM456在小鼠肝脏及肺部的分布水平，进一步对肺部组织切片进行荧光组化分析表明，TM456主要定位于肺内微血栓中，而无CREKA五肽的对照组中则无法在肺血栓中检测到TM456的存在。综上所述，与TM456单体蛋白相比，TM456纳米胶束在保留抗凝辅因子活性的前提下，具有大幅提升的血浆半衰期及血栓靶向性，可以预期本项目的研究对抗凝血蛋白药物的开发及改造工作提供有用的理论数据。