中碳链脂肪酸单甘油酯靶向作用外膜磷脂酶A抑制大肠杆菌生长的机制研究

Medium carbon chain fatty acid monoglyceride (MCFAM) has an effective antibacterial effect on Escherichia coli (E. coli), however，the intrinsic molecular mechanisms are still unclear. Recent studies had indicated that mutant E. coli-MlaA can activates the outer membrane phospholipase A (OMPLA) by overexpression, and further resulting in hydrolysis of phospholipids (PLs), undermine the integrity of the cell membrane by depleting the inner membrane of phospholipids. This project will research the mechanism of MCFAM in inhibiting the growth of Escherichia coli by specific binding to OMPLA. On the basis of previous studies, E. coli which overexpression OMPLA will be constructed, and the products will further be purified. The interaction sites and mechanisms of OMPLA and MCFAM will be detected by various techniques. MCFAM inhibits the growth of E. coli, the change of outer membrane and inner membrane will be checked, OMPLA and dimer, lipopolysaccharide will be analyzed. OMPLA gene knockout E.coli strain will be prepared to further elucidate the role of OMPLA in the inhibition of E. coli growth by MCFAM. In this study, we will prove the bacteriostatic mechanism of MCFAM to E. coli, and provide theoretical guidance for the design of broad-spectrum, highly effective food preservative or antimicrobial molecules.

中碳链脂肪酸单甘油酯(MCFAM)对大肠杆菌有较好的抑菌作用，但至今未见有关从分子层面探明MCFAM抑菌机制的研究和文献报道。最近研究发现一种大肠杆菌脂质不对称维持转运蛋白（MlaA）显性突变株，过量表达MlaA而激活OMPLA，导致外膜磷脂水解，进而消耗内膜磷脂而破坏细胞包膜完整性。本课题将在前期研究基础上，研究MCFAM靶向作用OMPLA抑制大肠杆菌生长的作用机制。拟采用多种技术在体外检测OMPLA与MCFAM的相互作用位点及方式。用MCFAM作用于E.coli，观察菌体外膜、内膜变化，分析OMPLA及二聚体、脂多糖的含量变化。制备OMPLA基因敲除E.coli菌株，进一步验证OMPLA在MCFAM抑制E.coli生长过程所起的作用。本项目的完成，将探明MCFAM对E.coli的抑菌机理，为设计广谱、高效作用的食品防腐剂或抑菌剂分子提供理论指导。

为了明确中碳链脂肪酸单甘酯(MCFAM)对大肠杆菌细胞的破坏机理，为开发广谱、高效作用的食品防腐剂提供理论指导。本研究从细胞及蛋白水平对中碳链脂肪酸单甘酯抑制大肠杆菌分子机理进行了一系列研究工作，包括：中碳链脂肪酸单甘酯作用大肠杆菌导致细胞损伤效应及形态变化，单癸酸甘油酯作用大肠杆菌导致外膜磷脂酶A（OMPLA）及其他膜蛋白的含量变化，制备相关基因敲除及回补菌株进一步验证OMPLA及其他膜蛋白的作用，OMPLA与MCFAM的体外结合方式。.以上工作表明单辛酸甘油酯改变外膜和内膜的通透性和完整性，导致细胞内膜收缩及崩解，膜电位下降，胞内核酸和蛋白质渗漏，杀死大肠杆菌。单癸酸甘油酯破坏内膜的磷脂双分子层，同时耗散质子驱动势，导致内膜外膜的通透性增加，细胞内容物泄露，达到抑菌作用。经蛋白质组学实验及GO功能富集和KEGG通路富集等生物学统计分析发现，单癸酸甘油酯作用大肠杆菌后，OMPLA蛋白表达没有变化，同时外膜蛋白ompX、ompC、ompA表达升高, ompF、ompW表达降低。单癸酸甘油酯对OMPLA和ompX基因敲除菌株的抑制率会降低，对OMPLA和ompX基因敲除回补菌株的抑制率较相应敲除菌会回升，对ompA基因敲除菌株的生长抑制率均高于大肠杆菌原始菌株，ompA基因敲除回补菌抑制率较相应敲除菌降低。进一步验证了OMPLA、ompX为单癸酸甘油酯对大肠杆菌抑菌作用的靶点。单癸酸甘油酯作用大肠杆菌后激活外膜OMPLA水解外膜磷脂，ompX有助于单癸酸甘油酯进入胞内，ompA可以维持膜的完整性和促进单癸酸甘油酯外排。利用大肠杆菌表达系统表达纯化OMPLA蛋白，运用光谱技术和虚拟分子对接解析了OMPLA与MCFAM的相互作用，MCFAM能与OMPLA蛋白相互作用并能促进其二聚化激活其酶活性，OMPLA二聚体与单癸酸甘油酯之间的作用力主要为非极性相互作用。.本项目阐明了中碳链脂肪酸单甘酯抑制大肠杆菌生长的机制，本研究成果为MCFAM的应用提供了一定的理论指导。