利用大肠杆菌脂肪酸生产长链二元酸

Long chain dicarboxylic acids (DCA) are widely used chemical materials. In order to reduce the demand for fossil resource, we propose to use fatty acids in Escherichia coli as substrate for DCA production. The first step is to produce fatty acids suitable for DCA conversion in E.coli via genetic engineering of fatty acid metabolism pathway. The main approaches are as follows: to overexpress the key fatty acid synthesis enzymes and thioesterase and block the degradation pathway; to specially modify the substrate channel of condensation enzyme FabB in order to increase 12 carbon acid in particular, because only 12 carbon acid could be efficiently converted to DCA; to overexpress the dehydratases FabA and delete fatty acid synthesis inhibitor FabR in order to increase unsaturated fatty acid level. Secondly, in an E.coli strain with all above modification, the P450 from Bacillus megaterium, Candida tropicalis and rat would be expressed respectively to produce DCA. The DCA conversion rate would be compared to establish fatty acid to DCA(12 carbon in particular) pathway in E.coli.

长链二元酸是一类用途广泛的化工产品，为了减少目前二元酸生产对石油等不可再生资源的依赖，我们尝试用大肠杆菌自身合成的脂肪酸为底物，转化产生二元酸。主要有两个步骤，步骤一是改造大肠杆菌脂肪酸代谢途径，大量合成易于转化成二元酸的脂肪酸底物。所采用的方法有：阻断脂肪酸降解途径，过量表达脂肪酸合成酶和硫酯酶，以提高脂肪酸产量；通过特异突变缩小缩合酶FabB的底物通道，以缩短脂肪酸链的长度，增加最易转化为二元酸的十二碳脂肪酸的比例；过量表达脱水酶FabA，敲除脂肪酸合成抑制因子FabR，以提高脂肪酸不饱和程度。步骤二是在整合了以上改造的大肠杆菌中，分别过量表达来源于巨大芽孢杆菌、假丝酵母和小鼠的P450羟化酶和NADPH-P450还原酶，对比其二元酸转化活性，在大肠杆菌中建立脂肪酸至二元酸（十二碳为主）转化系统。

脂肪酸是一种重要的细胞结构分子，可便利地转化成多种可再生生物能源。脂肪酸经羟化酶和脱氢酶作用获得的长链二元酸是一种精细化工产品；脂肪酸经硫酯酶切割ACP产生的丁烯酸是很好的化工原料和有机中间体；脂肪酸脱羧获得的长链烷烃是高性能航空燃料。.本项目对大肠杆菌脂肪酸代谢的多种基因fabH，fabB，fabA, fabZ，fabF，fadR，fadD 和fadE进行了过表达或敲除；并分别表达了拟南芥硫酯酶（atfata）、大肠杆菌硫酯酶（tesA）和加州月桂硫酯酶（ucte）。因此构建了二十多种大肠杆菌脂肪酸表达体系，对其脂肪酸产量、十二碳酸含量和不饱和程度进行比较：.1、提高脂肪酸总产量。通过过量表达脂肪酸降解抑制因子FadR，阻断脂肪酸的降解途径；过量表达tesA，释放游离脂肪酸；结合发酵条件优化等手段，最终使大肠杆菌脂肪酸总产量达到15 g/L，与野生型相比提高了6倍。.2、十二碳酸比例的提高。通过在大肠杆菌中过量表达ucte和FabH，使大肠杆菌C12:0含量达总脂肪酸的58%，与野生型相比提高了16倍，其产量为7.6 g/L。.3、不饱和脂肪酸含量升高。通过过量表达FadR抑制脂肪酸的β氧化；敲除fadD阻断脂肪酸降解途径；过量表达tesA，产生游离的不饱和脂肪酸，使不饱和脂肪酸含量升至57.8%，与野生型相比提高了3.5倍，其产量为9g/L。. 以上获得的十二碳酸含量高、不饱和程度高且脂肪酸总含量高的大肠杆菌菌株，为脂肪酸向二元酸、丁烯酸和烷烃转化的研究奠定了重要基础，具体如下：. 1、脂肪酸转化为二元酸。将假丝酵母、巨大芽孢杆菌和小鼠的P450复合酶在大肠杆菌中表达，均未检测到二元酸的积累。可能原因是P450蛋白分子量很大，在大肠杆菌中不易表达、蛋白质易错误折叠或缺乏NADPH还原酶的辅助等，因而没有生物学活性。. 2、脂肪酸转化为丁烯酸。在大肠杆菌中表达多形拟杆菌硫酯酶时，我们意外的发现丁烯酸含量增加明显。通过在大肠杆菌中表达多形拟杆菌硫酯酶，敲除大肠杆菌体内脂肪酸降解关键酶fadD，添加特异性抑制剂三氯生抑制FabI的活性，优化培发酵条件等手段，丁烯酸的发酵水平达到4.0 g/L。. 3、脂肪酸转化为长链烷烃。在大量表达fadR且缺失yqhD脂肪醛还原酶的菌体中表达脂酰ACP还原酶和脂肪醛氧化酶，烷烃和烯烃的产量达到255.63 mg/L。