黄曲霉 CSN 复合体亚基 CsnE 控制产孢和黄曲霉毒素合成的机制

Fungal CSN complex has an impact on sporulation, light signaling, secondary metabolism and so on. Aspergillus flavus produces aflatoxin which causes economic losses and risk of food safety by contaminating of grains, food and feed. The biosynthesis of aflatoxin depends on the native living environment of A. flavus. Regulation of aflatoxin by CsnE subunit of CSN complex responding to environmental stresses is an effective way to control A. flavus and aflatoxin production. The aims of current proposal are: 1) to identify the molecular function of CsnE subunit of CSN complex by analysis of cullin neddylation states and cullin stabilities by western blot; 2) to asses the impact on biological processes by phenotyping assay of WT and mutants; 3) to reveal the mechanisms of that CsnE control the production of spore and aflatoxin by light signal by RNA-seq, Western blot, two-dimensional electrophoresis, gene knock out, bioassay of mutant, tandem affinity purification and mass spectrometry coupling mass spectroscopy and bimolecular complementation. The results will provide comprehensive understanding production of aflatoxin and pathogenic mechanisms and lead to the development of an effective control strategies for A. flavus and aflatoxins.

真菌的CSN复合体影响了产孢、光信号响应和次级代谢等生物学过程。黄曲霉产生的黄曲霉毒素可污染粮食、食品及饲料等造成严重经济损失和导致食品安全问题，而黄曲霉特定的生存环境可以影响黄曲霉毒素的产生。通过基于环境作用于CSN复合体亚基CsnE来调控黄曲霉毒素产生是防控黄曲霉毒素的有效途径之一。本项目首先构建AfcsnE的突变株, 利用Western blot分析cullin蛋白的Nedd8化修饰和cullin蛋白的稳定性，明确 AfcsnE的生物学功能；其次通过对突变株表型的系统研究解析AfcsnE参与的生命过程；最后利用RNA-seq、双向电泳、基因敲除、串联亲和纯化结合质谱和双分子荧光互补等技术分析AfcsnE在不同光照下控制产孢和黄曲霉毒素合成的机制。研究结果不仅为了解黄曲霉的产孢子和产毒的机理提供理论知识，而且有利于发展防控黄曲霉及黄曲霉毒素的的新策略。

黄曲霉毒素对粮食、食品及饲料的污染等造成了严重经济损失和食品安全问题。黄曲霉特定的生存环境可以影响黄曲霉毒素的产生。通过基于环境作用于CSN 复合体亚 基 CsnE来调控黄曲霉毒素产生是防控黄曲霉毒素的有效途径之一。本研究利用真菌生物学、分子生物学、生物信息学以及组学等方法揭示黄曲霉中CSN 复合体亚基 CsnE的功能和作用机制。主要结果如下：(1) 黄曲霉基因组编码CSN复合体亚基AfcsnE ，基于同源重组的原理构建了AfcsnE 的缺失突变株（ΔAfcsnE）和回补菌株（ΔAfcsnEC）。(2) 黄曲霉CSN复合体亚基AfcsnE 在光信号响应、菌落生长、分生孢子和菌核的产生、氧化胁迫和DNA损伤应答、黄曲霉毒素AFB1产生和次级代谢中发挥重要作用。持续光照条件下，ΔAfcsnE菌株的菌落直径显著大于野生型；持续光照、黑暗交替和持续黑暗条件下，ΔAfcsnE菌株的产孢量与野生型相比差异极显著；AfcsnE基因的缺失导致菌核的消失。与野生型和回补菌株相比，敲除AfcsnE 导致黄曲霉对氧化试剂偶氮二甲苯敏感性下降，而对DNA损伤试剂MMS敏感性增加。当野生型、ΔAfcsnE菌株和ΔAfcsnEC菌株在YES培养基培养时，ΔAfcsnE 菌株产生的黄曲霉毒素显著高于野生型和 ΔAfcsnEC 菌株；而在花生上寄生时，ΔAfcsnE 菌株产生的黄曲霉毒素AFB1产量明显低于野生型和回补菌株，在玉米培养时，黄曲霉毒素AFB1产量在野生型和AfcsnE 突变株没有明显区别。(3) 转录组结果表明光照条件下，和野生型相比，ΔAfcsnE菌株差异表达基因最多，其次是光暗交替，最少的是持续黑暗的条件。产孢相关基因转录水平在三种条件下都有差异。合成次级代谢产物的骨架基因在三种光照条件下转录水平均有显著差异。而黄曲霉合成基因簇组成基因的转录水平没有显著差异。蛋白组结果显示与野生型相比，ΔAfcsnE菌株在三种光照条件下黄曲霉毒素合成基因的表达显著减少，在光照和光暗交替时分生孢子合成相关基因和次级代谢基因表达水平显著差异。由此可见黄曲霉中CSN 复合体亚基 AfcsnE 在RNA和蛋白质两个水平调控了生长发育和次级代谢，这将为挖掘新颖天然产物和利用光照控制黄曲霉及其毒素提供理论基础。.在项目执行期间，发表了学术论文2篇，其中SCI收录1篇，中文核心期刊1篇；培养了硕士研究生2名。