黄曲霉DNA甲基化模式及其在黄曲霉毒素生物合成中的调控作用研究

黄曲霉毒素(AF)为具极强致癌性的真菌次级代谢物，其生物合成调控已成为研究微生物次级代谢调控的模型。前期我们对黄曲霉全基因组甲基化进行了测序，发现其DNA甲基化模式与动植物的甲基化模式存在相当大的差别，并且发现，用甲基转移酶抑制剂5-AC处理黄曲霉导致AF合成水平降低，暗示DNA甲基化可能与AF合成存在正相关性，同时，在黄曲霉中发现存在类似DNA甲基转移酶的基因。本项目以黄曲霉全基因组甲基化测序结果为基础，围绕DNA甲基化与AF生物合成的关联，发现黄曲霉基因组甲基化谱和AF代谢途径/调控基因的甲基化谱特征；通过获得DNA甲基化差异基因表达数据和DNA甲基转移酶功能数据，阐明AF生物合成受DNA甲基化调控的作用机理，寻找DNA甲基化调控的基因或调控元件。通过该研究，为真菌次级代谢特别是真菌毒素代谢调控机制的阐明及AF污染控制策略的发展提供重要基础。

黄曲霉毒素(AF)为具极强致癌性的真菌次级代谢物，其生物合成调控机制相当复杂。本项目围绕黄曲霉DNA甲基化与黄曲霉毒素生物合成，开展了以下五方面研究并取得了较好的研究结果：①发现DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-AC）可以诱导黄曲霉产生白色绒毛状表型并可显著抑制AF合成。②通过全基因组DNA甲基化测序与分析，首次证明黄曲霉是一种缺乏DNA甲基化的物种，并发现黄曲霉跟酵母一样，处于真菌DNA甲基化进化进程中的一个断裂点。这是继果蝇、面粉甲虫、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、线虫之后，科学家发现的第6种缺乏DNA甲基化的物种。③通过转录组学方法对5-AC对AF生物合成的抑制作用机理进行了解析，发现5-AC处理后使VeA蛋白浓度水平降低，弱化甚至中断VelB与LaeA的连结，可能是它继而对黄曲霉生长发育和次生代谢相关基因的表达模式产生改变所致，同时发现负责编码无性孢子形成的基因brlA的表达在5-AC处理后明显上调。④通过基因敲除和过表达DNA甲基转移酶同源物基因（DmtA），从生长发育、孢子产生、基因表达、AF生物合成、菌核产生等方面对DmtA的功能进行了详细的研究，发现：DmtA对黄曲霉的生长发育无影响，但影响无性孢子的形成；DmtA敲除后AF含量下降，过表达则AF产量增多，由此初步推测DmtA基因可能与黄曲霉的次级代谢存在关联；DmtA基因影响菌核的形成，DmtA敲除株几乎不产菌核，而过表达株则产生大量菌核；DmtA敲除株中的brlA基因有明显上调，而过表达株中则明显下调，AF基因簇中的基因在敲除株中有下调，过表达株中有上调，但调控因子laeA、veA、AflR、AflS并没有明显变化。⑤对黄曲霉基因组结构进行了深入研究，如完善了黄曲霉基因组注释，比之前网上的注释增加了1025个新基因；分析了黄曲霉重复序列注释与RIP指数，发现黄曲霉的重复序列显著低于其他真菌，RIP指数明显高于其他真菌，提示RIP可能也存在于包括黄曲霉在内的部分曲霉属真菌中；对核糖体蛋白基因表达变化与总体转录和翻译进行了关联分析，为反映基因组总的转录能力提供基础；分析了DmtA在真菌中的进化规律，发现它与已证实具DNA甲基化生物的DmtA有很大差异。本研究共发表论文9篇，培养研究生10人，在全国相关会议上作会议报告7次。该研究为真菌毒素代谢调控机制的阐明提供了重要基础。