乙酰化修饰调控黄曲霉毒素合成的分子机制

Aflatoxins are a group of secondary metabolites mainly produced by Aspergillus flavus, which are known to be one of the most toxic and carcinogenic natural contaminants. Our previous study had shown that histone deacetylase inhibitor TSA decreased aflatoxin production, which implied that histone acetylation might have important role in AF biosynthesis. In this study, a bioinformatics method would be applied to identify histone acetyltransferase (HATs) and deacetylase (HDACs) of A. flavus. By cloning genes and purifying proteins, we could assay its protein activity in vitro. Gene knockout strategy was used to study the function of the HATs and HDACs in vivo. Furthermore, according to our previous acetylome of A. flavus, several proteins with acetyl modification related to aflatoxin biosynthesis would be identified. Gene knock-out and point mutation strategy will be applied to reveal acetylation functions in regulation of AF biosynthesis. Finally, we could reveal the regulation mechanism of acetylation to fungal development and aflatoxin biosynthesis by Chromatin immunoprecipiation (CHIP) and Western blotting assays. This research will make contributions to early prevention and control of AF, and also provide regulation references for the biosynthesis of other microbial secondary metabolites.

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌产生的次级代谢产物，是目前发现毒性和致癌性最强的天然污染物。本课题组前期通过去乙酰化酶抑制剂TSA处理黄曲霉，发现黄曲霉毒素B1显著下降，提示乙酰化修饰参与了黄曲霉毒素的合成调控，但如何影响黄曲霉毒素的产生及调控机制仍不清楚。本项目拟从TSA处理黄曲霉菌为出发点，筛选并鉴定黄曲霉乙酰转移酶和去乙酰化酶，通过体外酶活实验和体内基因敲除实验，研究关键乙酰化酶和去乙酰化酶对黄曲霉毒素合成的影响；结合乙酰化蛋白组结果，找到乙酰化修饰调控的靶标和位点，结合基因敲除和点突变深入研究靶蛋白和靶位点与黄曲霉毒素合成的关系；进一步通过CHIP和Western blotting，阐明乙酰化调控黄曲霉毒素合成的机制。本研究可为黄曲霉毒素危害的早期防控提供理论依据，并对微生物次生代谢产物的调控机制提供重要参考。

组蛋白乙酰化主要是通过组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶 （HDAC）在组蛋白H3和H4的N-端的赖氨酸残基上维持乙酰化的平衡。研究表明乙酰化修饰在丝状真菌的生长和次生代谢产物的合成中应该发挥着重要作用。本研究以黄曲霉菌为材料，旨在阐明乙酰化修饰对黄曲霉毒素合成代谢的调控机理。通过生物信息学分析，本项目筛选出黄曲霉基因组中乙酰转移酶和去乙酰化酶。通过基因敲除进行遗传学功能研究，确定参与黄曲霉毒素合成的乙酰转移酶和去乙酰化酶。进一步对乙酰化调控靶标及靶位点的乙酰化修饰水平的研究，深入探讨HATs与HDACs如何通过对靶标蛋白的乙酰化修饰水平的改变，最终调控黄曲霉毒素的合成。结果发现HDAC家族参与了黄曲霉的生长、菌丝尖端形成、分生孢子产生、菌核形成，和真菌毒素合成，并参与了菌体对氧化胁迫响应。本研究体外表达了HosA，测定其酶活指数，揭示HosA蛋白在黄曲霉体内能发挥对H4K16去乙酰化酶的功能，并通过cAMP信号途径，以及通过直接调控毒素合成结构基因影响毒素合成。揭示了Sirtuins家族在黄曲霉菌产孢、孢子萌发率、毒素合成、胁迫响应和侵染中的关键作用。本研究还揭示了HAT家族GcnE和Rtt109的乙酰化位点，及其通过靶位点正向调控黄曲霉的发育、疏水性、产毒、致病性和对环境因子胁迫的敏感性。 项目还揭示了非必需Myst酶的乙酰基转移酶活性和靶位点，及其在黄曲霉发育、产毒和致病性中的关键作用。Chip-seq分析表明MystB通过H3K14ac调节黄曲霉的发育，产毒和氧化胁迫响应。本研究还鉴定了乙酰化蛋白组，研究乙酰化修饰在黄曲霉毒素合成中的作用，结果显示乙酰化蛋白参与了黄曲霉毒素合成和黄曲霉的致病性。本研究成果有助于全面揭示乙酰化在黄曲霉生长发育、次生代谢和致病性中的调控网络，为黄曲霉污染的早期防控提供新的靶标，为曲霉菌治疗靶标药物开发奠定理论基础。