脂氧素A4对血管内皮细胞TF/TFPI表达的影响及机制研究

脂氧素A4（LXA4）是国际上新近发现的一种重要的炎症反应"停止信号"。但是仍目前未见LXA4对凝血系统方面的研究，而凝血活性与血栓形成密切相关。项目组前期研究发现LXA4可抑制血管内皮细胞TF的表达。本项目研究LXA4对原代血管内皮细胞TF/TFPI表达的影响，并探讨其信号转导机制及转录调控机制。采用原代血管内皮细胞及SD大鼠研究LXA4对TNF-α诱导的血管内皮细胞表达TF/TFPI的影响；发色底物法检测TF/TFPI活性；Westernblot及RT-PCR检测TF/TFPI表达；Westernblot检测多种信号转导蛋白的磷酸化水平；放射激酶法测PKA、PKC活性；激光共聚焦测细胞内钙离子浓度；EMSA法检测NF-κB及IκB-α结合活性；双荧光素酶报告基因技术研究TF基因上游启动子AP-1及Egr-1的转录调控作用。本研究可阐明血栓形成的部分机制，为防治血栓提供重要的理论依据。

脂氧素A4（LipoxinA4, LXA4）是炎症过程中产生的具有特征性三羟四烯结构的花生四烯酸衍生物，目前研究证实LXA4 具有调节促炎因子/抗炎因子的平衡、抗氧化、调节组织修复、保护内皮细胞功能的作用。本研究首次发现：① LXA4可以在mRNA、蛋白及活性水平上明显抑制TNF-α诱导HUVECs细胞TF的表达，LXA4对HUVECs细胞TFPI表达无影响；② LXA4可抑制TNF-α诱导的Akt、p38MAPK 、p44/42MAPK、SAPK/JNK磷酸化水平，这四种信号途径与LXA4抑制HUVECs细胞TF表达有关；③ cAMP-PKA/PKC依赖的信号途径以及PI3K-Akt依赖的信号途径在LXA4抑制TNF-α诱导的HUVECs细胞TF抗原表达起了重要的作用，但也可能还存在其他较次要的信号传导途径作用。而cAMP-PKA/PKC依赖的途径以及PI3K-Akt依赖的信号途径对TFPI抗原的表达无明显影响。④首次证实了TF基因5′上游序列中AP-1元件、Egr-1元件在TNF-α对TF诱导反应中具有重要调控作用，LXA4可能通过调节AP-1、Egr-1转录因子表达而部分调控抑制TNF-α诱导的TF基因的诱表达；⑤ LXA4可能通过抑制NF-κB p65的表达而抑制TF的表达， LXA4抑制TNF-α诱导 HUVECs细胞IκB-α磷酸化，使NF-κB失活，从而抑制TNF-α诱导HUVECs细胞TF表达，提示IκB-α磷酸化使NF-κB失活可能是TNF-α诱导 HUVECs细胞TF抗原表达的转录调控机制之一。⑥ LXA4能显著抑制TNF-α诱导的脐静脉内皮细胞内[Ca2+]i升高，LXA4抑制TNF-α诱导脐静脉内皮细胞的TF表达可能与抑制细胞内钙离子溶度有关。⑦ 在动物整体模型水平上证实LXA4可以抑制由TNF-α诱导的HUVECs细胞TF抗原的表达。本表明LXA4可以作为一种生理性抗血栓成分防止血栓形成，可为进一步开发LXA4作为生理性抗血栓新药提供理论基础。LXA4这种抑制TF表达的作用受多条信号途径的调节，可通过特异性信号转导抑制剂调节TF的表达。本研究阐明了LXA4抗血栓形成的部分机制，并为防治血栓形成提供重要的理论依据。