马兜铃酸物质基础与致癌毒性研究

Herbal medicines containing Aristolochic acids (AAs) have drawn a great attention due to their carcinogenic risk in recent years. Metabolic activation of AAs could result in the formation of DNA adducts and the consequent mutagenic and carcinogenic effects. AAs represent a family of natural products including many analogues, AA I and II are well-studied, however, other analogues and their implication in cancer may have been overlooked. The content ratio of analogues in Aristolochia plants varies with plant species, and their contribution of carcinogenic potential are still unclear. In this research project, we will use gpt delta transgenic model mice to compare the genetic toxicities of those AAs analogs, by determination of DNA adducts formation and gpt mutation frequencies, to identify the analogues with higher toxic potential. Quantitative dose-response analysis will be performed in gpt mice treated with identified AAs analogues in low dose level, multi-endpoints including DNA adducts formation, chromosome aberrations and gene mutations will be integrated. Exposure-response relationships will be analyzed by using benchmark doses (BMDs) approach, derive point of departure (PoD) metrics will be calculated for extrapolation to acceptable exposure levels in human. Further clinical studies will be conducted to study the implication of AAs in certain cancer, by determining both AAs-DNA adducts and AAs-induced mutational signature in the tumor. Our studies will provide useful data for the carcinogenic risk assessment of AAs and regulation of AAs-containing herbal medicine.

含有马兜铃酸(AAs)的中药可能具有致癌风险，近年来受到广泛关注。AAs是一类结构类似的化合物总称，这类化合物代谢活化后能与DNA生成加合物、诱导基因突变从而诱发肿瘤。AAs不同类似物在各药材中含量不同，各类似物致癌性差别也尚不明晰，因此难以有针对地制订可保障安全性的限量标准。本项目拟使用转基因模型动物，对AAs类似物进行DNA加合物分析和致突变性对比研究，鉴别主要毒性类似物；进一步以该类似物为研究对象，在动物体内以DNA加合物、染色体损伤和基因突变为检测终点，在低剂量范围内设计多剂量组，采用基准剂量法分析剂量-毒性效应关系，通过模型拟合计算遗传毒性效应起始剂量，外推人群摄入限量建议值。进行初步临床转化研究，在特定癌症患者肿瘤样本中分析目标AAs类似物的DNA加合物，通过测序分析AAs特征性突变，考察AAs暴露与相关癌症发生的相关性。本项目为评估AAs致癌风险和制订监管措施提供科学依据。

AAs-DNA加合物造成DNA 损伤是AAs发挥致癌作用的分子起始事件，因此定量/定性检测AAs-DNA加合物是所有AAs致癌性相关研究的基础，本项目成功建立了基于HPLC-MS/MS技术的检测方法，并进行了应用研究。首先，进行了AAI遗传毒性定量分析，利用BMD法，从DNA加合物检测、基因突变和染色体损伤等多个遗传毒性终点，对 AAI 遗传毒性进行定量分析，确定了AAI的毒性起始剂量，结果可为AAs人群转化进行风险评估和监管决策制定提供参考数据；其次，方法应用于临床研究，动物实验发现AAI靶器官除了泌尿系统，还可诱导肠道基因突变，我们收集肠癌患者肿瘤样本进行研究，发现AAs暴露与人肠癌发病基本不具有相关性；此外，发现AAs类似物之间具有毒性协同作用，其机理为，不同类似物对P450代谢酶和负责AAs还原代谢的主要代谢酶NQO1具有竞争抑制作用，结果为不同AAs类似物复合暴露的代谢机制和遗传毒性研究等提供基础；此外，通过计算化学和实验手段得到了AAs类似物结构与毒性之间的构效关系，我们采用计算机定量构效关系的QSAR分析方法对128个AAs类似物进行了毒性预测，然后通过体外细胞进行高通量、高内涵毒性测试，发现8, 9, 10-位如有羟基存在，利于AAs代谢解毒，其中，10位羟基的存在大大降低了DNA反应性和遗传毒性。最后，我们鉴定出了无毒类似物AAIVa，我们应用HPLC-MS/MS中性丢失扫描方法对马兜铃和青木香提取物进行DNA加合物筛选，进行体外DNA反应实验，发现除了已知AAI和AAII，AAIVa也可以与DNA形成加合物，但是，动物体内没有表现遗传毒性和肾毒性，机制研究发现AAIVa主要在体内被代谢解毒，并且pH值可能影响AAIVa羟基去质子化，从而影响与DNA的反应性。作为展望，认为本课题的意义在于明确AAs毒性机理，最终才能实现用药的安全有效。AAs迄今为止药效和靶点尚不清楚，我们对AAIVa的药理作用初步研究，发现AAIVa具有抗炎作用，后续将继续探索靶点，最终为AAs临床安全使用提供理论依据。