含马兜铃酸中药肾毒性成分在体内长期滞留环节及蓄积特征的研究

服含马兜铃酸（A A）中药引起肾病倍受关注。前期研究表明除AA外，马兜铃内酰胺（AL）也有肾毒，而AL在植物界分布更广，涉及仍在应用的马兜铃、鱼腥草、胡椒、朱砂莲等，以及众多相关成药。AA肾毒性与体内长期蓄积有关，甚至在停用含AA药物一年以后仍能在病人血中测到此类物质。目前马兜铃酸肾病患者仍不断出现，其肾毒机制急需阐明。迄今的研究尚未能解释什么机制使该类物质在体内长期滞留蓄积？以何形式存在？或以DNA加合物形式存在？本项目拟研究在长期灌胃含AA中药关木通或AA给大鼠后，检测在其血浆血细胞肝肾肌肉骨骼等全部脏器/组织中AA-I及其代谢物AL-I、DNA加合物、AA代谢酶等的给药期间及停药后阶段的含量及分布总量的经时变化，探讨各脏器/组织中三者总量之间关系的经时变化规律，以阐明AA-I在何部位以何形式滞留，又以何形式转运不断流入致毒器官肾脏等蓄积而致毒。这对AA的肾毒机制阐明及临床诊治意义重大

中草药中马兜铃酸（AA）及马兜铃内酰胺（AL）类成分具肾毒性，与体内长期蓄积有关。本项目关注此问题开展研究，取得如下成果。.大鼠灌胃给予关木通水煎液，成功建立AAs和ALs大鼠体内蓄积模型，在给药期间和停药2个月模型大鼠体内均检测到AAs和ALs。利用UV、HPLC-DAD/FLD和LC-MS技术，建立了模型大鼠体液和组织中AAs和ALs定性、定量方法，检测到28个原型和代谢成分，指认了其中13个成分结构。通过分析，确定了AAs和ALs在大鼠体内分布和主要成分的经时变化。明确了肝脏和肾脏为主要蓄积部位。本研究首次在胸腺和脂肪组织中发现AAs，在给药各时间及停药2个月后均检测到AAs，且脂肪中存在毒性原型成分AA-I和AA-II。.通过建立HPLC-FLD-DAD方法，以HPLC-FLD检测加合物，HPLC-DAD检测脱氧核苷，定量模型鼠停药后组织中AA-DNA加合物，发现停药8周后肝和肾中仍检测到dA-AA-I、dA-AA-II，提示形成加合物是AA蓄积机制之一。对模型大鼠肝肾中AA致毒代谢酶NQO1和CYP1A2研究，发现在给药初期均被激活且量增加，停药后酶活及酶量仍以高水平持续2-8周，提示与AAs在体内长时间蓄积性密切相关。在分析测定的基础上，探讨了体内AAs和ALs、DNA加合物和相关代谢酶三者之间的关系及经时变化。.研究制备抗AA-I、AA-II和抗AL-FI单抗获得成功，建立了ELISA法和免疫印迹法等多项免疫分析方法。 用于分析AA-I和AA-II总含量，且能可视化检测AA-I和AA-II的存在部位。采用过氧化酶免疫光镜和胶体金免疫电镜技术的免疫组化检测法可发现AA集中在给药小鼠的肾皮质近端小管顶端，出现在线粒体和过氧化物酶体中，此为过氧化酶体首次被发现有AA-I分布。.以AA-DNA加合物为AA生物标志物，首次利用激光共聚焦显微镜分析发现AA-I在1h内进入人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞），并大量分布胞核中，少量聚集于线粒体。基于AA单抗结合免疫沉淀技术，在HK-2细胞中发现AA-I结合的靶蛋白alpha-actinin-4，该蛋白首次被发现可能和AA-I引起的肾脏疾病密切相关；在给予AA的小鼠肾组织中亦首次发现数个AA-I结合的靶蛋白。本研究结果为马兜铃酸蓄积机制提供有力证据。 .本项目已发表SCI论文和申请专利共7项，培养博士2人、硕士4人。