中国遗传性痉挛性截瘫家系SPG19致病基因候选克隆的研究

遗传性痉挛性截瘫(HSP)是一组具有明显临床和遗传异质性的神经系统变性疾病。在已发现的42个HSP致病基因位点中，只有17个致病基因被克隆。本研究以中国的一个五代HSP大家系为研究对象，全基因组扫描已将该家系的致病基因定位在SPG19，利用NimbleGen序列捕获技术把定位区域全部候选基因序列富集在芯片上，结合新一代高通量solexa测序技术筛选与鉴定SPG19致病基因。以斑马鱼为动物模型，探讨斑马鱼spg19基因在胚胎发育中的功能。利用RNAi knockdown 技术构建斑马鱼截瘫疾病模型,分别通过注射人的野生型和突变型SPG19 mRNA进行营救实验，观察表型缺陷是否恢复。同时将进行SPG19基因型和表型的关系研究。通过本研究将阐明HSP遗传异质性，揭示SPG19致病基因突变的致病机制，为SPG19亚型早期临床诊断，基因诊断和产前诊断提供理论依据，并为SPG19临床治疗提供新思路。

本课题以采用全基因组扫描定位（9q33–q34）致病基因为SPG19的中国一个遗传性痉挛性截瘫大家系为研究对象，利用NimbleGen序列捕获技术把定位区域全部候选基因序列富集在芯片上，结合新一代高通量solexa测序技术筛选与鉴定SPG19致病基因。经过生物信息学分析选取ciz1、ENG、HSPA5、PTGS1、SET和OR1J2共6个基因的6个SNP位点进行 PCR直接测序，结果显示前4个位点与solexa测序结果不一致，后2个 基因位点家系内不共分离。随后利用全基因外显子组重测序技术寻找来自不同分支的4个患者的基因组序列。对这4个样本进行高级生物信息学分析，结果显示在SPG19致病基因定位区域范围内没有发现4个样本共享的基因突变位点。我们也尝试了扩大到全基因组范围内找该家系的致病基因,经过生物信息学分析及基因功能预测最终挑选2个位点，分别是 IFT172 R1599C和TCF25 A536T，经过PCR直接测序和家系内共分离分析最终排除了以上2个基因不是该家系的致病基因。尽管没有克隆到SPG19致病基因，但我们的研究结果提示SPG19致病基因可能在于基因CNV拷贝数的改变或调控序列（如RNA和DNA甲基化改变）的改变或大片断外显子缺失等原因，用以上研究方法可能检测不到，为最终克隆SPG19基因奠定基础。SPG19基因型和表型的关系研究中，神经电生理的检查显示了2个患者右腓总神经的CMAP波幅下降。胫神经SNAP波幅大部分正常，SNCV延长。EMG显示两个患者运动单元和募集电位减少。MEP则显示AT和FMI的CMCT明显延长。上肢和下肢的脊髓和皮质刺激CMAP波幅在正常范围内。SPG19患者MR存在遗传异质性。MRI研究显示大多数SPG19患者有不同程度胼胝体萎缩。部分患者表现出脑白质异常及脊髓萎缩。以上基因型和表型的关系研究，为SPG19亚型早期临床诊断提供理论依据。以斑马鱼为动物模型，研究zfyve27 （SPG33）基因在斑马鱼胚胎发育中的作用。zfyve27在斑马鱼胚胎发育过程中尤其是神经系统的发育中起了极其重要的作用，是促进轴突生长发育所必需的。zfyve27 morpholino knockdown产生了运动神经元发育不正常，尾部卷曲，游动能力受损的表型。这种疾病表型为系统详细地分析遗传性痉挛性截瘫的病理机制奠定了基础。