乳腺癌治疗新靶点-BKCa通道在其形成过程中的作用机制研究

乳腺癌为最常见恶性肿瘤之一，目前的综合治疗模式虽然取得了一定效果，但复发和转移仍是影响乳腺癌患者生存的重要要因素，特别对于三阴乳腺癌患者现在仍无法得到满意的治疗效果及预后。钾离子通道与肿瘤的发生及恶性改变密切相关，但其作用机制目前仍不甚清楚。在我们的前期工作中证实特异性激活大电导钙激活钾通道（large conductance calcium-activated K+ channel，BKCa）可诱导乳腺癌细胞系MCF-7凋亡，提示BKCa通道可能参与调控乳腺癌得形成过程。因此，本项目拟采用电生理膜片钳技术，细胞分子生物学技术从整体，细胞与基因多个水平探讨BKCa通道对乳腺癌增殖与凋亡及侵袭转移的作用机制。本研究可对阐明BKCa通道与肿瘤形成的关系提出新见解，并可望BKCa通道成为乳腺癌临床治疗的新靶点。

BKCa通道可能参与了乳腺癌的发生与发展过程，我们在前期实验中发现唑来膦酸可显著增强乳腺癌细胞系的BKCa通道电流，为了验证BKCa通道是否参与乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭与血管形成等过程，我们选择了MDA-MB-231和MCF-7细胞系与转染了BKCa通道亚基基因的HEK293细胞，利用膜片钳技术记录唑来膦酸对BKCa通道电流的影响；通过免疫细胞化学与流式细胞仪检测细胞凋亡，并检测了细胞内Ca2+与线粒体膜电位的变化；以MTT与PCNA免疫组化染色来检测细胞的增殖；以划痕实验与transwell小室检测细胞的侵袭与转移能力；以人脐静脉内皮细胞的体外成环实验以及鸡胚尿膜囊来检测血管的形成能力。最后，我们建立了MDA-MB-231细胞的裸鼠种植瘤模型，观察了BKCa通道抑制剂IBTX在唑来膦酸治疗乳腺癌组织中的作用。我们的主要实验结果如下：.1、唑来膦酸通过激活BKCa通道诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞的凋亡：通过膜片钳技术我们证实MDA-MB-231与MCF-7乳腺癌细胞系上均有BKCa通道的存在。对MDA-MB-231细胞而言，唑来膦酸可显著增加BKCa通道的活性，而激活的BKCa通道可诱导MDA-MB-231细胞凋亡，其机制涉及胞内Ca2+浓度的升高与线粒体膜电位的去极化。我们还把BKCa通道亚基转染到HEK293细胞上，证实唑来膦酸激活BKCa通道的作用靶点就在a亚基上。对MCF-7而言，唑来膦酸也可激活MCF-7细胞的BKCa通道，但BKCa通道的激活却不能诱导细胞凋亡。 2、唑来膦酸通过激活BKCa通道抑制MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭以及血管生成：我们发现唑来膦酸可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移与侵袭能力，也可明显降低HUVECs的体外成环与CAM的体内血管生成，但BKCa通道阻断剂IBTX或TEA则可部分逆转唑来膦酸的这种作用。本实验结果表明唑来膦酸激活的BKCa通道不但可促进MDA-MB-231细胞的凋亡，还可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭、以及血管的形成。3、唑来膦酸通过调控BKCa通道抑制MDA-MB-231细胞裸鼠皮下种植瘤的生长：我们观察到注射唑来膦酸可抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞种植瘤的生长，且种植瘤组织的凋亡、粘附与血管生成相关基因均发生改变。