联合抗原表位确定技术与分子对接进行抗体HAb18的人源化改造

利卡汀是全球首个用于治疗肝癌的单抗类药物，由我校自主研发。由于该药是鼠源性抗体，临床应用中会产生人抗鼠抗体反应，同时由于缺少抗体的Fc段，因此也没有天然抗体所能介导的生物学功能。抗体人源化是改造抗体的有效手段之一，但人源化抗体往往伴随着亲和力不同程度的丧失。本项目拟利用质谱、核磁共振技术和X射线晶体衍射等技术确定HAb18G/CD147抗原表位和空间三维结构，从而在保证抗体结合活性的基础上进行人源化改造。在生物信息学的指导下，利用获得的数据对抗体进行同源模建和人源化设计。根据设计的人源化方案，表达突变的若干抗体并评价它们的免疫原性和亲和力，择优作为储备抗体。从而能够从多角度、系统性地建立一种新的抗体人源化方法，最大程度保留抗体的亲和力，提高药物分子对接的效率和准确度，更有效的减少人力、物力和药物开发周期，为基于抗原-抗体相互作用位点结构的抗体药物设计提供新思路。

抗体治疗是生物治疗的一种，它的重要性越发明显。为了降低抗体药物的HAMA反应，基于蛋白质结构信息发展了一系列改造抗体的方法。随着分子生物学的发展，嵌合抗体和人源化抗体的出现，成为了解决抗体应用中降低HAMA反应的有效途径，但改造的抗体往往伴随着亲和力的大幅下降。.本研究建立了一种新型的抗体人源化方法，首次联合基于质谱的表位确定技术和分子对接对抗体进行人源化改造。通过鉴定出HAb18G/CD147的抗原表位进行HAb18抗体的人源化设计，这样就在保证了抗体HAb18亲和力的基础上进行人源化改造，之后通过基因重组技术合成新的抗体片段并检测该抗体片段的生物学活性。.首先制备了HAb18G/CD147抗原表位肽，对制备的HAb18G/CD147抗原表位肽进行MALDI-TOF MS分析，并与PeptideCutter软件预测的胰酶酶切HAb18G/CD147各肽段分子量进行对比，得到了HAb18G/CD147抗原表位肽的序列信息。其次，建立了一套新的人源化抗体的方法，首次将基于MALDI-TOF MS抗原表位确定技术引入到分子对接中，建立了HAb18G/CD147和HAb18的分子对接模型，完成了HAb18可变区的人源化设计，确定突变的氨基酸位点为H42E，H90A和L43S。再次，根据已选择的突变位点，用overlapping PCR的方法合成了新的基因并克隆至表达载体，测序验证正确后转化到E. coli中诱导表达，经Ni2+柱纯化后获得了较纯的HAb18-huscFv。SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白分子量约为27kDa。经SPR法测定，HAb18-huscFv与HAb18-scFv相比亲和力无明显差异。用细胞免疫荧光法检测HAb18-huscFv与肝癌细胞SMMC-7721具有一定结合能力。最后，我们发现CD147的剪接体Basigin-2在卵巢癌中高表达并与淋巴结转移相关，Basigin-2的高表达提示卵巢癌患者的不良预后。Basigin-2在卵巢癌细胞中能明显促进MMPs的分泌，增强卵巢癌细胞的侵袭转移能力。这说明Basigin-2在卵巢癌中是一个潜在的治疗靶点，我们的人源化抗体HAb18-huscFv在卵巢癌治疗中有一定的潜在应用价值。