内皮素受体B介导心肌营养素－1治疗自身免疫性心肌炎的实验及分子机制。

Cardiotrophin-1(CT-1) is an important regulator of immune myocardial injury and microcirculation disturbance.Cardiotrophin-1 is expected to be the target of the heart failure of autoimmune myocarditis,but the mechanism is not clear.In our previous study we proposed transmembrane protein signal enhancer hypothesis and verify the role of CT-1 in angiogenesis.The characteristics of the seven transmembrane protein endothelin receptor B(ETBR) is similar with signal enhancer,which is an important transmembrane signaling molecule .Based on previous studies we propesed that CT-1 is a target to treat autoimmune myocarditis. The mechanism may be regulation of seven transmembrane protein ETBR, leading to the Th1/Th2, Th17/Treg imbalance and trigger a cascade of reactions and immune imbalance ,realize its role through the process of angiogenesis, myocardial hypertrophy. We prepared rat autoimmune myocarditis model,ETBR knockout rat model and lentivirus carrying CT-1,ETBR and ETBR siRNA, immune injury was observed in the study.We observed the effect of CT-1 on the signaling pathways on myocardial microvascular endothelial cell and cardiac function of the autoimmune myocarditis rats.The role of ETBR in the CT-1 induced process were be studied,we also affirmed the molecular mechanism involved.

心肌营养素－1(CT-1)是免疫性心肌损伤和微循环障碍的重要调控分子，有望成为自身免疫性心肌炎心力衰竭的干预靶点，但其作用机制尚不明确。我们在既往研究中提出了跨膜蛋白信号增强器的假设并验证了CT-1的促血管新生作用。七次跨膜蛋白ETBR具有信号增强器的特征，是信号传导的重要跨膜分子。基于前期研究我们提出CT-1可能通过ETBR跨膜蛋白的调控，导致Th1/Th2平衡、Treg/Th17失衡，促发级联反应及免疫失衡，通过血管新生、心肌肥大等干预自身免疫性心肌炎。本项目通过制备自身免疫性心肌炎大鼠模型、ETBR敲除大鼠模型及携带CT-1、ETBR及ETBR siRNA基因的慢病毒，以免疫损伤为切点，观察CT-1对心肌微血管内皮细胞信号通路的影响及实验性自身免疫性心肌炎的干预作用，探讨ETBR介导CT-1作用的细胞和分子机制，为CT-1干预自身免疫性心肌炎免疫性损伤和心力衰竭提供理论依据。

制备自身免疫性心肌炎(EAM)大鼠模型, 通过ETBR过表达观察ETBR过表达对EAM的影响；通过敲低和过表达FGL2基因来探索FGL2在EAM中作用的分子机制；使用RNAi慢病毒沉默FGL2基因，超声心动图检测心功能指标，心肌组织HE染色观察炎症情况，免疫组化检测ETBR、JAM-C、E-selectin和ICAM-1蛋白表达情况；RT-PCR及Western blot检测心肌组织中ETBR、IFN-γ、IL-12、IL-17、IL-4、JAM-C、E-selectin、ICAM-1、MCP-1、MIP-1α、TLR9、CTLA-4、Foxp3、RORγt 、PD-1、ETBR和ICAM-1mRNA及蛋白的表达水平、ELISA检测血清中INF-α、NF-κB、BNP, IL-6, IL-17,AMA水平。组织病理学显示与对照组相比，EAM-FGL2大鼠的炎性细胞浸润增加。EAM大鼠Foxp3和RORγt蛋白和mRNA水平在统计学上有所提高（P <0.05）。在过表达FGL2的EAM大鼠血清中INF-γ，IL-6，IL-17和BNP水平显着增加。EAM大鼠心脏中的TLR9上调。初次免疫后（21天），心肌炎模型组的心脏功能得到改善（P <0.05）。与心肌炎模型（EAM）组相比，RNAi治疗组的INF-α和NF-κB水平较低（P <0.05）。与EAM组相比，组织中TLR9蛋白和mRNA水平相对应的炎症评分明显降低（P <0.05）。EAM组大鼠ICAM-1的蛋白表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），ETBR-oe组与EAM组比较，ICAM-1的蛋白表达水平显著降低（P < 0.01）。结论：FGL2在EAM的发病机制中起着重要作用，其中涉及PD-1/PD-L1途径；FGL2通过调节TLR9信号传导途径减轻EAM大鼠心肌炎。在EAM中ETBR过表达可以阻止T淋巴细胞归巢，减轻病理损伤并改善心功能。ETBR过表达阻止EAM T淋巴细胞归巢，主要机制可能与抑制ICAM-1等T淋巴细胞归巢相关分子的表达有关。