fgl2对自身免疫性心肌炎诱导的免疫损伤的治疗作用及分子机制的实验研究

Immune injury play an important role in the development of myocarditis,the preliminary study indicated that the fgl2 gene silencing reduced myocardial expression of TLR4 and improve the heart function of autoimmune myocarditis rat model.TLR4 is an important target for regulation of immune injury.Based on our preliminary studies,Speculate that fgl2 has an important role in the regulation of immune injury in myocarditis.In this study, using the model of autoimmune myocarditis in rats by RANi interference blocking fgl2 expression, observe that fgl2 silence reduces immune injure in autoimmune myocarditis rat model ,observe the effect of fgl2 on the structure and function of the heart,clarify the role of fgl2 in experimental autoimmune myocarditis immune injury and molecular mechanism involved,including Treg/Th17 balance,cytokines network, Tetraspanins networks,and confirm the biological effects of fgl2.

免疫损伤在心肌炎发生发展中起重要作用。前期研究发现fgl2基因沉默下调心肌TLR4表达并改善自身免疫性心肌炎大鼠模型的心功能，TLR4是调控免疫损伤的重要靶点，因此我们推测fgl2是治疗心肌炎免疫损伤的重要靶点。基于前期研究，推测fgl2在心肌炎免疫损伤中具有重要作用。本研究采用自身免疫性心肌炎大鼠模型，通过RANi干扰阻断fgl2的表达，观察fgl2对自身免疫性心肌炎大鼠模型心脏功能和结构的影响，明确fgl2沉默对自身免疫性心肌炎大鼠模型免疫损伤的影响，明确fgl2调控Treg/Th17平衡、TLR4/NFκB通路、Tetrasanins网络、细胞因子网络等免疫损伤激活重要病理过程的作用；阐明fgl2治疗实验性自身免疫性心肌炎免疫损伤的作用及分子机制，并明确其生物学效应。

建立自身免疫大鼠心肌炎模型，探讨toll样受体9（TLR9）在自身免疫性大鼠心肌炎中的表达情况，以及以慢病毒介导的人纤维介素2（Fgl2）作为治疗靶点，明确对自身免疫性大鼠心肌炎的可行性及其相关机制；大鼠尾静脉注射Fgl2过表达慢病毒载体，明确过表达Fgl2对PD-1通路的影响及机制研究。行心脏超声心动图；心肌组织做HE染色，观察各组大鼠心肌的炎症情况，ELISA检测血清中IL-6、INF-α及NF-κB炎症因子的水平及BNP水平，流式细胞术检测血清中的CD4+CD25+T细胞百分比。RT-PCR及Western blot检测心肌组织Fgl2、TLR9、CLTA-4、PD-1、Foxp3、RORγt的mRNA及蛋白表达。 大鼠心脏超声检查结果显示，RNAi组较EAM组心功能好转（P<0.05）。血清学检查显示EAM组大鼠血清INF-α及NF-κB水平在急性期达到高峰（初次免疫后21d），血清中的IL-6水平在慢性期（免疫后第40d）达到高峰，明显比其他各组增高（P<0.05），RNAi组相比于EAM组炎症因子水平有所降低（P<0.05）。初次免疫后的第21d，EAM组的心肌炎症评分、TLR9蛋白以及mRNA地表达量等均较其他各组增高（P<0.05），RNAi组较EAM组炎症评分以及TLR9的蛋白表达量减少（P<0.05）。EAM大鼠HR、LVEF、LVFS较NC组降低，EAM-Fgl2组降低更明显（P<0.05）；EAM-Fgl2组血清BNP、IL-6、IL-17及IFN-γ的水平较EAM组明显升高（P<0.05）EAM组Fgl2、RORγt、Foxp3的mRNA及蛋白表达量均较NC组增高（P<0.05），PD-1的mRNA及蛋白的表达量较NC组降低，EAM-Fgl2组Fgl2过表达使Fgl2的mRNA及蛋白表达量明显增高，PD-1的mRNA蛋白表达量则较EAM组进一步降低（P<0.05）。结论：Fgl2慢病毒介导基因沉默慢病毒介导的可明显改善心肌炎大鼠心功能，其机制与TLR9通路有关；Fgl2过表达可下调PD-1的表达，上调免疫性心肌炎大鼠血清中炎症因子的表达，加重心肌炎性程度，使心功能恶化更明显。