心肌Ito钾通道中硫化氢（H2S）分子开关的定位及其功能研究

Our previous work and pilot studies have clarified that H2S directly targets at the pore-forming subunit of Ito potassium channels, the Kcnd2 subunit. And the disulfide bond serves as a molecular switch for H2S to regulate the structure and function of the Ito potassium channels. Using recombinant DNA technology combined with electrophysiological technology, the present project aims to investigate the mechanisms underlying the regulation of H2S on the Ito potassium channels and the physiological role of this effect. This includes identification of disulfide bonds contained in Kcnd2 and clarification of the function of this bridge bond. We will also investigate if H2S regulates the structure and function of the Ito potassium channels via this molecular switch. The physiological role of this H2S effect on action potential, absolute refractory period, and severe ventricular arrhythmia induced by acute ischemia will also be examined. The study not only helps to clarify the mechanisms underlying H2S-induced regulation on ion channels and to develop new approaches for the treatment of severe ventricular arrhythmia induced by acute myocardial infarction.

在前期工作和预实验已明确H2S直接作用与Ito钾通道孔形成亚单位Kcnd2以及二硫键是H2S调控其靶分子结构和功能的分子开关的基础上，结合基因重组技术和电生理技术，研究H2S调控Ito钾通道的分子开关机制及其生理意义，包括确定Kcnd2中二硫键的确切位置及其功能，以及H2S是否将其作为分子开关调控Ito钾通道的结构和功能；还包括研究H2S通过调控Ito钾通道对心肌细胞动作电位时程、绝对不应期以及急性心肌缺血时严重室性心律失常的作用。研究工作的意义不但有助于揭示H2S调控心脏离子通道结构和功能的机制，还有助于探索治疗心性心肌梗死所致严重心律失常的新方法。

急性心肌梗死是高死亡率、高发病率的重大疾病, 在发病后至得到手术抢救之前有1-2小时的危险窗口期, 在这一关键窗口期中最主要的危险是发生致命性心律失常。目前的针对措施是在救护车到达的第一时间现场注射利多卡因, 但效果尚不够理想。本项目基于前期工作和预实验，结合基因重组技术和电生理技术，聚焦硫化氢（H2S）调控Ito钾通道的分子开关机制及其生理意义。研究发现H2S对Ito钾通道有抑制作用，这种抑制作用能够通过突变Kv4.2亚单位中的Cys320和/或Cys529残基而被消除。H2S能够打开氧化的半胱氨酸残基中的二硫键，但是不能作用于单个的半胱氨酸残基。H2S能够延长心外膜心肌细胞的动作电位时程并且在大鼠的心肌梗死模型中，通过靶向于Kv4.2中的Cys320/Cys529模体抑制心肌细胞中Ito钾通道，发挥对致死性心律失常的复率作用。H2S对其他离子通道如IK1和INa无影响。H2S治疗能够通过对室性早搏以及致死性心律失常的保护显著延长心梗后2小时窗口期内大鼠的存活率至对照组的1.4倍。本研究首次提供了H2S能够调节Ito钾通道以及H2S能够调控离子通道中特异性模体的相关证据，提出了一种运用H2S化学供体治疗的新方法，其逆转致命性心律失常的效果优于现有药物利多卡因，有望在临床推广应用后降低急性心肌梗死的死亡率（论文: Antioxidants & Redox Signaling.23(2), 2015;专利: 201410632955.9）。发表标注本项目资助的SCI论文4篇，核心期刊论文2篇。相关内容申请中国发明专利1项，获得授权1项。此研究成果是在历时十余年的关于H2S心血管调节及其机制的前期系列工作 (Cardiov. Res. 2007; AJP, 2007; Cardiov. Res. 2008; ARS, 2010; AJP, 2010; ARS, 2013; ARS, 2013; ARS, 2014)基础上取得的具有重大应用价值的转化医学突破，而且阐明了其作用机制，即H2S通过调控Ito钾通道蛋白中特异性Cys320/Cys520分子开关, 抑制Ito钾通道电流，从而产生抗心律失常作用；也是首次提出气体小分子通过调节离子通道分子开关而调控其功能的新理论。