PITX1对胃癌抑瘤作用分子途径及其调控机制的研究

Pitx1 is specially concerned in inhibiting Ras signaling transduction pathway activation as a candidate tumor suppressor gene. Down-regulation expression of PITX1 in multiple cancers implys that PITX1 may participate in tumor carcinogenesis. Other groups and ours found that PITX1 expression is also reduced in gastric cancer. Our study presented over-expression of PITX1 could inhibit the gastric cell lines' growth markedly via blocking the cell cycle and promoting cell apoptosis. These results demonstrates the application prospect of PITX1 in clinical therapeutics. We will employ ChIP, ChIP-PCR-Seq and yeast two-hybrid to lucubrate the regulation network comprising PITX1 as a transcription factor and downstream molecules as well as their epigenetic mechanism from gastric cells to animal models based on our previous work. The further study of the regulation and signaling transduction pathway PITX1 takes part in gastric carcinogenesis will provide a novel theoretical basis for gastric cancer inhibition and treatment.

Pitx1作为候选抑癌基因因其参与抑制Ras信号传导通路激活而受关注。PITX1蛋白在多种肿瘤中表现为低表达模式，提示其参与肿瘤的发生发展。我们及其他研究者研究均发现胃癌组织中Pitx1基因的低表达模式。我们近期研究亦发现Pitx1基因导入致胃癌细胞周期阻滞及细胞凋亡，明显抑制了细胞增殖能力。这些结果提示Pitx1基因在胃癌抑瘤治疗上具有应用潜力。本研究将在前期研究基础上，从细胞模型到动物模型深入探讨Pitx1基因对胃癌的抑瘤作用及效果，并分析PITX1作用所涉及的信号传导通路；应用ChIP、ChIP-PCR-Seq.、酵母双杂交等方法，揭示PITX1作为转录因子对肿瘤相关基因的表达调控，并初步探讨Pitx1基因表达的表观遗传调控机制。PITX1在胃癌发生中涉及的信号传导通路及调控方式的深入探讨，将为阐明其抑癌作用途径及其调控机制提供新的依据，为胃癌的发病机制阐明和治疗提供一个新的观点。

胃癌发生的遗传因素主要有癌基因的激活和抑癌基因的失活等。近年来越来越多的研究表明PITX1的异常表达与多种肿瘤的发生有关，但PITX1在肿瘤发生中的作用及其调控机制并不清楚。本研究首先分析了PITX1在胃癌细胞中的生物学功能，发现PITX1过表达和沉默后能明显抑制或促进胃癌细胞的增殖能力，究其原因主要为PITX1影响细胞周期G1/S期转变和影响了caspase 3、9剪切体的表达，可能通过线粒体途径参与胃癌细胞凋亡。 通过ChIP-seq技术系统的捕获到PITX1结合的基因。生物信息学分析提示，PITX1结合基因参与细胞的各种各样的生物学过程。本研究以TP73和PDCD5为候选者，进一步探讨了PITX1如何通过结合下游基因的启动子区影响基因的转录，参与胃癌细胞的凋亡。此外，为了探讨PITX1的表达调控机制，本研究通过miRNA microarray/软件预测获得可能调控PITX1的候选miRNA，并通过荧光素酶活性分析实验等初步证实PITX1可能受miR-19a-3p的调控。应用CCK-8法检测过表达PITX1的胃癌细胞系AGS、BGC对化疗药物5-FU和顺铂（CDDP）的敏感性变化，以及PITX1敲低表达的胃癌细胞系MCG和7901对5-FU和顺铂（CDDP）的敏感性变化。分析CHIP-seq数据中PITX1可能调控的下游与化疗耐药相关的基因，挑选凋亡相关基因PDCD5做进一步分析，RT-qPCR检测PITX1对PDCD5的转录调控。结果发现，过表达PITX1明显增加了胃癌细胞AGS和BGC对5-FU与顺铂（CDDP）的敏感性，敲低PITX1则减弱了胃癌细胞MCG和7901对5-FU与顺铂（CDDP）的敏感性。CHIP-seq检测到PITX1结合的区域参与细胞死亡和凋亡过程相关的基因居多，以凋亡相关基因PDCD5作为候选，在胃癌细胞系中分析PITX1对PDCD5转录水平的表达调控。综上研究结果提示，PITX1参与胃癌细胞的生物学行为的变化，并以结合到基因启动子区的方式调控下游基因TP73和PDCD5表达，且PITX1的表达水受miR-19a-3p的调控。本研究结果为胃癌发病机制的探讨和胃癌的分子治疗提供了理论依据和实验基础。