受宿主诱导的大丽轮枝菌milRNA1的鉴定及功能分析

V. dahliae Kleb. (V. dahliae) is the major pathogenic fungus of the cotton wilt disease which causes devastating losses in China and the World. The disease is very difficult to control due to the lack of effective defense approaches. Recently, host-induced gene silencing (HIGS) has been developed as a new effective strategy to defend pathogenic microbes by introducing functional small RNAs (sRNAs) into host plants. The uptake of host RNA interference triggers by pathogenic fungi is probably evolved as a natural biological function in fungus-host interaction. However, due to the lack of the profound understanding of RNA silencing pathways in pathogenic fungi, the mechanism of the trans-kingdom RNA silencing remained largely unclear. We have previously isolated several miRNA-like sRNAs (milRNAs) in V. dahliae that are induced in infected cotton plants, implying they are involved in fungus-host interaction. This project intends to extensively study one of the most highly induced milRNAs in V. dahliae, named milRNA1, to characterize the precursors and synthetic pathway of milRNA1, to illustrate the mode of target regulation, and to reveal the function of milRNA1 in fungus-host interaction and stress response. The obtained results will, for the first time to our knowledge, reveal the synthesis pathway of sRNAs and the sRNAs induced silencing pathways in V. dahliae, and will also establish the roles of RNA silencing in mediating fungus-host interaction, thus providing theoretical base for further development of the disease defense tools using HIGS.

大丽轮枝菌是棉花黄萎病的主要致病菌，目前尚缺乏有效的防治措施。近年来宿主诱导的基因沉默作为一种新的抗病手段被用来抵御多种病原微生物的侵入，而且可能是一种天然存在的植物抗病策略。然而，由于大部分真菌自身小RNA诱导沉默途径尚不清楚，这种异源RNA诱导的沉默机制更难以进行研究。申请人前期从感病棉花分离的大丽轮枝菌中检测到一类受诱导的真菌内源小RNA，分析发现它们是一类microRNA-like的小RNA（milRNA），可能参与了致病菌与宿主的互作。在此基础上，本项目拟以受诱导最强的milRNA1为研究对象，鉴定其前体序列及合成途径；寻找其靶标基因并分析其诱导沉默的作用方式；并探索其在病原菌致病性及胁迫应答过程中的功能。研究结果将首次揭示黄萎病致病菌中小RNA的合成途径和沉默机制，为进一步研究RNA沉默在真菌与宿主互作中所发挥的功能奠定基础。

大丽轮枝菌是棉花黄萎病的主要致病菌，目前尚缺乏有效的防治措施。近年来宿主诱导的基因沉默作为一种新的抗病手段被用来抵御多种病原微生物的侵入。然而，由于大部分真菌自身小RNA诱导沉默途径尚不清楚，极大地限制了该策略在植物保护中的广泛有效的应用。我们前期通过测序和生物信息学分析发现，大丽轮枝菌编码一类microRNA-like的小RNA（milRNA），可能参与了致病菌与宿主的互作，并利用大丽轮枝菌的参考基因组鉴定到一系列沉默相关基因。在此基础上，本项目以表达丰度较高的VdmilRNA1（VdmilR1）为研究对象，完成了以下三方面的研究:（1）鉴定VdmilR1的前体及合成途径；（2）预测并验证VdmilR1的靶标基因并鉴定出其对靶标的调控方式；（3）解析VdmilR1及其靶标基因在致病性中的功能。. 研究结果显示，（1）VdmilR1的前体位于基因间区，由RNA聚合酶 II转录而成。其成熟体不依赖于大丽轮枝菌编码的DCL和AGO蛋白，而由另一个含有RNase III结构域的蛋白VdR3参与合成；（2）VdHy1是VdmilR1的靶标基因，其靶点位于3’-UTR区，并以序列配对形式与靶标位点结合抑制其表达。进一步的实验发现VdmilR1并没有在靶标位点对VdHy1进行剪切，而是通过组蛋白H3K9的甲基化修饰来抑制靶标基因的转录；（3）VdHy1是大丽轮枝菌致病所需的毒性因子。通过检测VdmilR1及VdHy1在侵染过程中的表达模式发现，VdmilR1/VdHy1模块在大丽轮枝菌侵染棉花中发挥着重要作用。. 本研究首次揭示黄萎病致病菌中的一种小RNA合成途径和沉默机制，拓展了我们对真核生物小RNA和RNA沉默途径的认识，为进一步研究RNA沉默在真菌与宿主互作中的功能奠定了基础，也为利用RNA沉默手段进行植物保护提供了理论依据。