硝酸还原酶产生的一氧化氮在调控灵芝酸生物合成过程中的作用机制研究

Ganoderma lucidum is an important medicinal fungi. As the major pharmacological activity compounds from G. lucidum, Ganoderic acids (GAs) content has been taken as an important measurement of the quality of G. lucidum. Our recent results showed that nitrate reductase (NR) might regulate the biosynthesis of GAs by producing nitric oxide (NO). However, the regulatory mechanism of this phenomenon is not clear. For further analysis of this regulatory mechanism, in this project, we construct the mutant strains of NR gene by RNA silence and gene over expression. Combined with the previous results that the regulatory function of ROS signaling pathway in GAs biosynthesis, we will analyze the interaction of NO signaling pathway and ROS signaling pathway in the regulation of GAs biosynthesis. By using laser scanning confocal microscope (LSCM), combined with the application of the NO donors, scavenger and synthetic inhibitors, the temporal of NO content, the transcripts of genes involved in GAs biosynthesis, as well as the changes of GAs contents, will be compared. At the same time, through the transcriptome sequencing and qRT-PCR, we will analyze the relationship among NO signaling, its downstream components and other signal transduction pathway (especially related to ROS). Based on this research, the molecular mechanism of the NO signaling pathway of GAs biosynthesis will be described clearly. These results will not only provide the knowledge of biological roles of NO in G. lucidum, but also provide theoretical basis for the development of other important terpenoid compounds and basidiomycete of other active ingredients to provide reference.

灵芝酸（GAs）是灵芝的主要药用成分，但因其含量较低，限制了灵芝药用价值的开发。申请者前期发现灵芝硝酸还原酶（NR）能够通过产生NO，调控GAs的生物合成，而这一调控作用的分子机制还不清楚。本项目拟采用基因沉默和过表达的手段，构建NR基因突变型菌株，并结合细胞生物学、分子生物学等手段，明确NR产生的NO对GAs生物合成的调控作用。进而结合前期研究所发现的ROS对GAs生物合成的调控作用，考察在GAs生物合成调控过程中，NO信号途径与ROS信号途径之间的交互机制。并通过转录组测序、荧光定量PCR等方法，探查在调控GAs生物合成过程中，响应NO信号转导途径调控的下游信号途径，进一步分析NO信号途径对GAs生物合成调控作用的分子机制。本研究有助于加深对GAs生物合成调控机制的认识，为生产上提高GAs含量提供理论基础，同时为更深入研究其它重要萜烯类化合物和担子菌其它活性成分的代谢调控提供借鉴。

灵芝酸（GAs）是灵芝的主要药用成分，但因其含量较低，限制了灵芝药用价值的开发。申请者前期发现灵芝硝酸还原酶（NR）能够通过产生NO，调控GAs的生物合成，而这一调控作用的分子机制还不清楚。本项目通过基因沉默等手段，构建了NR基因突变型菌株，并结合细胞生物学、分子生物学等手段，明确NR产生的NO对GAs生物合成的调控作用。研究结果显示在响应MJ调控GAs生物合成的过程中，NR及其产生的NO可能位于ROS途径的上游，通过调控ROS产生酶NOX及ROS清除酶系的水平，从而改变表内ROS含量，进而能够调控灵芝重要次级代谢产物GAs的生物合成。同时，也发现在响应热胁迫调控GAs生物合成的过程中，NO信号可能与钙信号产生较为复杂的相互调控作用，进而能够调控灵芝中GAs的生物合成。进一步分析发现，灵芝中具有NO代谢关键酶亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）也能够参与NO对ROS和GAs的调控过程。通过构建GSNOR的基因沉默突变菌株，GSNOR沉默后能够提高CAT酶活，进而缓解热胁迫产生的ROS，从而影响热胁迫对GAs生物合成的调控。与此同时，研究发现灵芝线粒体丙酮酸转运蛋白（MPC）能够响应多种能够引起胞内NO信号转导途径变化的环境胁迫，对GAs的生物合成具有明显的调控作用。本研究相关成果有助于加深对GAs生物合成调控机制的认识，为生产上提高GAs含量提供理论基础，同时为更深入研究其它重要萜烯类化合物和担子菌其它活性成分的代谢调控提供借鉴。