灵芝三萜生物合成调控过程中关键转录因子基因的克隆及其在三萜生物合成中作用分析

Ganoderma lucidum is an important medicinal fungi. As the major pharmacological activity compounds from G. lucidum, triterpenes content has been taken as an important measurement of the quality of G. lucidum. Previous studies have confirmed that triterpenes are synthesized via the mevalonate pathway (MVA pathway) in G. lucidum. In the MVA pathway, structural genes and their promoters have been isolated and characterized. Several cis-acting elements responsing to environmental have been found in their promoters. Based on the prophase work, the yeast one hybrid system will be used to clone the genes encoded the transcription factors binding with the cis-acting elements which are widely appeared in the promoters. Firstly, we will study the characteristic expression and binding profile of these transcription factors. On the other hand, the roles of these transcription factor genes in triterpene biosynthesis would be analyzed using gene-overexpression and RNAi methods. These researches will be helpful for further elucidate the mechanism of triterpene biosynthesis, and provide theoretical basis for improving medical value of G. lucidum. Meanwhile, it will deepen the understanding of the terpenoid compounds biosynthesis, which might benefit further studies on other important terpenoid compounds biosynthesis.

灵芝三萜是灵芝的主要药用成分，但由于其含量较低，极大限制了灵芝药用价值的开发。灵芝三萜的生物合成是通过甲羟戊酸途径完成，申请者前期已克隆到灵芝甲羟戊酸途径中多个关键酶基因及其启动子，发现一些环境响应相关顺式作用元件在这些启动子中广泛分布，但与这些元件结合的转录因子对灵芝三萜生物合成的调控机理尚未明确。本项目在前期研究基础上，以获得的重要环境响应顺式作用元件为诱饵，利用酵母单杂交的方法，克隆与之相结合的转录因子基因；研究这些转录因子表达特性及与启动子序列的体外结合特性，同时通过应用过表达和RNA 干扰技术，进一步研究转录因子基因对灵芝甲羟戊酸途径中一系列关键酶基因的调控作用，阐明这些转录因子基因在灵芝三萜生物合成中的作用。本研究将有助于进一步加深对灵芝三萜生物合成分子机制的认识，为生产上提高灵芝三萜含量提供理论基础，同时为更深入研究其它重要萜烯类化合物和担子菌其它活性成分的代谢调控提供借鉴。

灵芝[Ganoderma lucidum（Curtis: Fr.）P. Karst]在我国有着悠久的应用历史，是一种传统药用真菌，有着“仙草”的美誉。但是，目前灵芝中主要药用成分三萜类化合物的含量较低，极大的限制了灵芝的药用价值，因此，提高灵芝中三萜类化合物含量，成为进一步提高灵芝药用价值的关键。本项目通过克隆环境调控相关转录因子基因响应环境信号诱导的转录因子，并通过构建相关转录因子的基因沉默表达菌株研究了这些基因在响应环境调控中的作用，发现这些转录因子参与调控灵芝三萜的生物合成，同时影响灵芝的菌丝生长。在此基础上，本研究发现NADPH氧化酶是胞内产生活性氧（ROS）信号分子的主要来源，谷胱甘肽过氧化物酶是维持胞内ROS平衡的重要环节，它们能够通过改变胞内ROS进而调控灵芝生长发育和次级代谢，同时发现茉莉酸甲酯（MeJA）对灵芝三萜生物合成和菌丝生长方面的诱导作用是通过ROS信号途径调控的。同时，本研究发现ROS含量能够显著影响胞内钙离子含量和钙信号调控相关基因。该结果说明在灵芝中，NOX和GPx能够调控次级代谢的生物合成和菌丝生长，为进一步研究灵芝胞内氧化还原系统和ROS信号转导途径提供重要的研究基础，有助于进一步加深对灵芝三萜生物合成分子机制的认识，为生产上提高灵芝三萜含量提供理论基础，同时为更深入研究其它重要萜烯类化合物和担子菌其它活性成分的代谢调控提供借鉴。