液体静置培养灵芝酸生物合成的表观遗传调控研究

Ganoderic acids have received wide interest due to their interesting pharmacological functions such as anti-tumor and reduce blood press activities, and their biosynthetic processes are regulated by numerous factors. Recent studies indicate that many filamentous fungal secondary metabolites are regulated by epigenetic modifications, which not only affect the titers of secondary metabolites, but also activate the cryptic gene clusters. Epigenetic remodeling was mainly carried out by DNA methylation and histone acetylation.This research should use chemical epigenetic modification and over express, missing or RNAi histone methyltransferase gene of epigenetics to change the chromosome form, study the influence of epigenetic modification on the growth, cell differentiation, biosynthesis of ganoderic acids and the expression of gene of epigenetics combinating with the pathway genes of ganoderic acids biosynthesis. To reveal the epigenetic regulation on ganoderic acid biosynthesis, and develop a powerful method to obtain novel ganoderic acid products.

灵芝酸具有抗癌和降血压等药理功能，其生物合成过程受众多因素的调控。表观遗传对丝状真菌次级代谢产物的生物合成具有调控作用,不仅影响产物的合成量，而且可能激活沉默基因簇而产生新的代谢产物。组蛋白的甲基化和乙酰化修饰是已知丝状真菌主要的表观遗传调控方式。本研究拟通过利用小分子化学表观遗传修饰试剂和过表达、缺失或RNA干扰组蛋白甲基转移酶基因（laeA）的表达而改变灵芝染色体的表观遗传修饰形式，研究表观遗传修饰对灵芝生长、细胞分化与灵芝酸代谢途径关键酶基因转录水平以及灵芝酸合成的影响，以期揭示表观遗传对灵芝酸合成代谢的调控规律，并挖掘灵芝合成新次级代谢产物的潜力。

灵芝是我国名贵中药，灵芝酸是具有抗癌和降血压等功能的三萜化合物。表观遗传对丝状真菌次级代谢产物的生物合成具有调控作用。DNA的甲基化和组蛋白乙酰化修饰是已知丝状真菌主要的表观遗传调控方式。本项目使用DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮胞苷（5-AC）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他（SAHA），分别调节灵芝细胞的DNA的甲基化水平和组蛋白乙酰化水平，研究小分子化学表观遗传修饰试剂对液体静置培养中灵芝细胞生长、分化、合成基因表达和灵芝酸代谢的影响。5-AC的处理对灵芝菌丝体的生长并无影响，但有利于灵芝酸的积累。5-AC的添加虽然显著抑制了孢子的形成，但单位孢子中积累的灵芝酸含量却明显增加，是对照的2.88倍，同时，灵芝孢子中四种单体灵芝酸（GA-Mk、GA-T、GA-S和GA-Me）的含量大幅度提高。抑制DNA甲基化促进灵芝酸合成关键酶基因hmgr、sqs、se和ls的表达。5-AC的处理虽然能降低基因组DNA的甲基化水平，但并没有改变sqs、ls和se基因启动子区域的甲基化状态，说明它不是通过改变这些基因启动子CpG位点的DNA甲基化状态来控制基因的表达。组蛋白乙酰化水平的提高同样不利于灵芝孢子形成，灵芝酸的合成量也下降，但对灵芝胞内多糖的合成却是有利的。研究发现，SAHA并不是通过抑制HDAC基因表达来提高组蛋白乙酰化水平。LaeA是真菌全局调控因子，是以SAM为底物的甲基转移酶。敲除LaeA基因的灵芝在静置培养中，上层菌丝生长茂盛，无性孢子形成推迟且数量明显减少，灵芝酸的合成也相应减少1.7倍，灵芝酸合成酶基因和孢子形成相关的velet基因表达量显著下降。总之，表观遗传修饰对高等真菌灵芝的灵芝酸生物合成具有明显的调控作用，灵芝无性孢子中大量累积灵芝酸，高表达全局调控基因LaeA可促进灵芝酸的合成。