基于冷冻电镜的双酰胺类杀虫剂激活鱼尼丁受体的结构研究

Diamide insecticides are very effective and broad-spectrum for pests, safe for the ecological environments and has novel mode of action. It is a revolutionary product after the discovery of neonicotinoids. It specifically activate ryanodine receptors (RyR) in the muscle ER and finally cause death to pests through uncontrollable contraction of muscles. However, it is still unclear about the binding sites of diamides on RyR since traditional methods such as biochemistry and pharmacology only get the partial information about the binding sites indirectly. We propose to use the newest cryo-EM technology to get the complex structures of RyR with three main diamides. Therefore, we can compare their different binding sites on RyR and the conformational changes before and after activation by insecticides. The results will provide important model and structural information for designing and developing new insecticides on RyR. At the same time, it will also help to study and explain the resistance mechanism come from target mutations.

双酰胺类杀虫剂具有高效广谱，对生态环境安全，作用机制新颖等突出优点，是继新烟碱类后的又一革命性突破。其通过特异性地激活害虫肌肉细胞内质网上的鱼尼丁受体RyR，从而导致害虫肌肉的过度收缩而最终死亡。但是，目前对双酰胺类在受体上的作用位点和作用方式一直没有研究清楚，因为传统的生化和药理学等方法都只能间接得到受体结合位点的部分信息。本研究将通过最新的冷冻电镜技术来获得氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺和氟苯虫酰胺分别与二化螟RyR结合的复合物结构，从而以最直接的方式比较不同双酰胺类杀虫剂在RyR上的作用位点，分析受体在被杀虫剂激活前后的构象变化，为设计开发新一代的作用于RyR的杀虫剂提供至关重要的结构生物学信息和模型依据，也为靶标抗性的分子机制研究提供理论和技术支持。

项目原计划通过最新的冷冻电镜技术来获得杀虫剂氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺和氟苯虫酰胺分别与二化螟鱼尼丁受体RyR结合的复合物结构，从而以最直接的方式比较不同双酰胺类杀虫剂在RyR上的作用位点。但是在经过两年不断的实验重复和失败后，始终无法分离纯化得到高质量的RyR蛋白。2020年，天津大学的团队根据已有的成熟技术纯化兔子骨骼肌内质网的鱼尼丁受体蛋白，获得了其与氯虫苯甲酰胺复合物的冷冻电镜结构，并在Nature Chemical Biology上发表该结果，提示昆虫可能和哺乳动物的结合位点是一样的。所以我们改变了项目的研究方向，针对另外两类与RyR同为杀虫剂靶标的离子通道，瞬时受体电位通道TRP和烟碱型乙酰胆碱受体nAChR进行研究。我们发现雌虫产卵器上的TRP通道可以作为阻断害虫产卵的杀虫剂分子靶点。另外，我们发现昆虫体内至少存在5种以上的nAChR受体亚型，分别由不同的亚基构成，是不同类型杀虫剂的主要分子靶标。该发现为害虫的抗性管理和基于靶标的杀虫剂分子设计和开发提供了理论基础，也为深入研究这些nAChR调节型杀虫剂的生态毒理学和风险评估提供了依据。