BmNPV病毒冷冻电镜高分辨结构解析及其受体识别研究

Although much of the early interest in baculoviruses was due to the threat they posed to the silk industry, baculoviruses play a major role in the control of natural insect populations. The molecular mechanism of BmNPV invasion and replication is progressing rapidly, but it needs to be explained systematically. The present project intends to introduce cryoEM into the structural biology of BmNPV and the study on the invasion mechanism based on virus high resolution structure. Firstly, the electronic data of BV, ODV or nucleocapsid of BmNPV will be taken by 300 kV cryoEM. Then, high resolution 3D reconstruction of BmNPV will be established using IHRSR and RELION. Finally, nearly atomic resolution structure of the active sites and viral protein related to the BmNPV invasion will be analyzed for providing a "structure" basis to screening the virus receptor. Meanwhile, the binding receptor protein of GP64 was identified by molecular biological experiment. A new method of "virus-cell" interaction based on BmNPV nearly atomic resolution structure was established to lay a foundation for the bidirectional interpretation of "virus structure-receptor protein". The results will accelerate the process of disease resistance breeding and prevention of virus disease of silkworm. It can also be used as a reference for the study of the initiation infection and double phase replication mechanism of nudivirus, panaeus monodon, and etc.

杆状病毒研究的焦点是对蚕桑产业的危害和自然界昆虫种群密度的控制，BmNPV入侵复制的分子机制等研究进展迅速，但有待系统阐释。本项目拟将生物冷冻电镜技术(cryoEM)引入到BmNPV的结构生物学研究，开展基于高分辨病毒结构的入侵机制解析。应用300kV的cryoEM收集BmNPV的BV、ODV病毒粒子或核衣壳等图像数据，进行“杆状、螺旋”BmNPV病毒的高分辨三维重构，从而解析病毒识别入侵相关蛋白/活性位点的近原子分辨结构，为BmNPV病毒受体筛选提供“蛋白结构”基础。同时以GP64病毒蛋白为例，通过pull-down等技术鉴定GP64病毒蛋白的结合受体，建立基于BmNPV高分辨结构的“病毒-细胞”互作研究新策略，为“病毒结构-受体蛋白”双向阐释BmNPV入侵机制奠定基础，有助于家蚕病毒病防控和抗病育种的研究，也可为痘病毒、对虾白斑病毒等相关病毒的启动感染、双相复制机制研究提供借鉴。

杆状病毒是一类对蚕桑产业造成重大危害的病毒，尽管其入侵及增殖复制的分子机制等研究进展迅速，但其生命周期及其调控机制仍有待进一步阐释。本研究应用了生物信息学、生化与分子生物学、蛋白表达和分析等技术方法，通过对BmNPV病毒和重组病毒的亚显微形态结构观察和分析，结合pull-down研究技术等，筛选BmNPV病毒GP64蛋白的细胞受体，并通过过表达、RNAi等实验验证，为最终阐述BmNPV入侵机制奠定基础。项目已通过蔗糖密度梯度离心，成功获取纯度高、结构完整、可用于冷冻电镜三维重构的BmNPV杆状病毒样品，应用FEI 300kV Titan Krios透射电子显微镜收集了BmNPV杆状病毒单颗粒数据；结合pull-down及蛋白质质谱技术筛选GP64蛋白的候选受体，包括TRAP1、BmFABP1、pic、sec61和BmREEPa等5个候选基因，并筛选获得一批与BmNPV增殖复制相关基因；经过分子生物学实验验证表明，家蚕TRAP1蛋白可显著促进BmNPV的增殖并增加子代病毒的毒力，家蚕BmCH25H蛋白依赖其羟化酶活性将宿主细胞中的胆固醇转化为25HC，从而发挥抑制BmNPV复制的功能。项目创新性地结合结构生物学、生物信息学和分子生物学，建立了BmNPV亚显微结构和生化分子生物学结合的“病毒-细胞”互作研究新策略，为阐释BmNPV入侵机制奠定基础，有助于后续开展家蚕病毒病防控和抗病育种等研究，也为探究BmNPV病毒生命周期及其调控机制、快速鉴定抗病关键基因及有效推动抗病家蚕选育平台的建立奠定了基础。