引导脂肪干细胞构建组织工程角膜基质样细胞片的研究

角膜病是第二大致盲性眼病，异体角膜移植是其唯一有效的治疗方法，但存在供体严重缺乏、术后发生免疫排斥反应等问题。以自体来源的干细胞构建组织工程角膜可解决供体材料缺乏和免疫排斥的两个关键问题。我们在前期研究工作中成功从人脂肪组织中分离培养了脂肪干细胞；并发现以压缩胶原为支架的三维培养系统可以使脂肪干细胞与支架复合体形成符合角膜基质结构特点的多层平行胶原薄板结构。在此基础上，本项目拟以脂肪干细胞为种子细胞，利用前期研究中开发的三维培养系统，结合不同诱导体系，探索诱导自体脂肪干细胞向角膜基质细胞分化的体外培养条件，以期构建出在形态结构、基因表达、细胞外基质表达等各个方面与角膜基质符合的组织工程角膜基质细胞片。为探索自体干细胞构建组织工程角膜的临床应用奠定基础。

利用体外三维培养模型探讨角膜基质病理生理过程近年来偶有报道。至今尚无利用人成体干细胞以体外三维培养体系诱导构建组织工程角膜基质的报道。本研究中，我们将人脂肪干细胞（Adipose-Derived Stem Cells, ADSCs）作为种子细胞，以压缩胶原为支架，形成细胞片，然后进行体外培养诱导，发现Advance培养基配合bFGF及VitC可以诱导ADSCs采纳角膜基质细胞表型。针对该培养体系，我们应用免疫荧光法在共聚焦显微镜下对细胞片进行形态学检测，发现细胞片内形成类似角膜基质样的多层平行细胞结构，ADSCs扁平生长于其中。我们利用Real-time PCR的方法动态检测到该细胞片表达角膜基质细胞功能学相关基因Keratocan、CHST6及B3GnT7明显升高。对于细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的分析，Western Blot动态检测到细胞片中有角膜基质特有蛋白聚糖Keratocan的表达，间接免疫荧光法检测到Keratocan及硫酸角质素（Keratan Sulfate, KS）表达于细胞片内。该体外三维培养体系可以构建与人角膜基质在形态、结构、基因表达及ECM表达上类似的组织工程角膜基质细胞片。