苗药黑骨藤中奎宁酸酯类化合物抗类风湿性关节炎药效及作用机制研究

Periploca Forrestii is commonly used in Guizhou folkloric and ethnic medicines for the treatment of rheumatoid arthritis (RA) by the Miao nationality. Different products made from it have been listed, with an obvious curative effect. The medicinal plant has been reported for its chemistry, pharmacological and clinical applications. However, the study on pharmacodynamic material basis of anti-RA remains unclear. The preliminary studies uncovered that a series of quinic acid esters mainly contained in the aqueous fraction subjected to MCI of the alcohol extract of Periploca forrestii that has effect on anti-AA in rats obviously, and the same activity with Tripterygium glycosides Tablet. In order to explore the mechanism of action of the compounds on Anti-RA in the whole animal, the cell-level and the molecular-level, based on the system research of chemical composition of active site, the AA rats model and the inflammation cell model which contains RAW264.7 cells and original generation synovial cells from knee of AA rats model, induced by LPS will be used. Besides, the effects of active fraction and monomeric compounds on inflammatory mediator, apoptosis associated proteins，and Oxidative stress level in cells and animal models will be investigated by the molecular biological technique of Immuncytochemistry, RT-PCR, ELISA, etc. The work will lay a scientific foundation for deep development and application of the medicinal plant Periploca Forrestii.

黑骨藤为贵州苗族常用药材，对治疗类风湿性关节炎（RA）疗效确切，已有多个中药品种上市，其化学、药理与临床应用已有报道，但有关其抗RA的药理效应及其作用机制尚不明确。在前期研究中，首次发现黑骨藤醇提物MCI树脂分段的水溶性部位含大量奎宁酸酯类化合物，该部位具有显著的抗大鼠佐剂性关节炎作用，活性与雷公藤多苷片相当。因此，本项目拟在活性部位奎宁酸酯类化学成分和其活性研究基础上，采用佐剂性关节炎大鼠模型、脂多糖诱导小鼠巨噬细胞模型和原代培养大鼠关节炎滑膜细胞释放细胞因子的炎症模型，应用免疫细胞化学染色、荧光定量PCR、ELISA等分子生物学技术，通过考察活性部位、奎宁酸酯类化合物对细胞和RA动物模型的炎症介质、凋亡相关蛋白及氧化应激水平的影响，从整体动物、细胞和分子水平探讨黑骨藤中奎宁酸酯类化合物的抗RA的药效及作用机制，为民族药黑骨藤的深层次开发利用提供科学依据。

黑骨藤为贵州苗族常用药材，对治疗类风湿性关节炎（RA）疗效确切，已有多个中药品种上市，其化学、药理与临床应用已有报道，但有关其抗RA的药效物质及其作用机制尚不明确。本课题采用多种分离纯化手段对黑骨藤抗RA活性部位进行系统化学成分分离，从中分离鉴定得到30个化合物，其中13个化合物首次从杠柳属植物中分离得到，5个化合物首次从该植物中分离得到，特别是首次从该植物中分离得到咖啡酰基奎宁酸类化合物，成分分析表明该类化合物为活性部位的主要成分。在此基础上，采用牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎（CIA）大鼠模型，以大鼠足肿胀程度，关节评分指数，踝关节病理检测，血清中类风湿因子（RF）及超氧化物歧化酶（SOD）水平为指标，在体内考察黑骨藤活性部位的抗RA的作用；同时考察黑骨藤活性部位及活性部位分离得到的10个主要单体化合物对MH7A细胞增殖抑制作用及抑制其分泌炎症因子的影响，筛选出较好的抗RA作用的活性成分，并采用Western blot法考察活性成分对iNOS、COX-2、IκB、NF-κBp65、JNK、ERK1/2及p38的蛋白表达或磷酸化水平的影响。结果，从体外和体内两方面，明确了咖啡酰基奎宁酸类化合物是黑骨藤抗RA作用的主要活性成分。对活性部位及活性单体机制研究表明，其一方面通过下调ERK1/2、JNK及p38的磷酸化水平，从而抑制MAPKs信号通路的激活来降低NF-κB活性；另一方面通过抑制IκB的磷酸化及IκB的降解进而下调NF-κBp65蛋白表达水平，进而抑制了下游炎症因子NO、IL-1β、TNF-α、PGE2、IL-6等的产生及iNOS和COX-2的蛋白表达，最终发挥抗RA作用。最后，建立紫外-可见光分光光度测定药材中有效成分总咖啡酰基奎宁酸酯类化合物含量和超高效液相色谱法测定3个咖啡酰基奎宁酸酯类化合物含量的方法，可用于药材质量控制。研究结果阐明了黑骨藤抗RA的药效物质及其作用机制，建立了活性成分的含量测定方法，为民族药黑骨藤的深层次开发利用提供科学依据。