α属冠状病毒S蛋白受体识别和细胞嗜性相关功能区的研究

冠状病毒（CoV）获得跨宿主感染的能力主要与病毒S蛋白的变异及导致的受体识别能力改变有关。通常，不同属的冠状病毒不会产生跨宿主感染。通过RNA定向重组技术将α属猫传染性腹膜炎病毒（FIPV） S 基因的膜外区置换β属鼠肝炎病毒（MHV）的相同区，得到重组病毒（fMHV），该病毒可在猫源细胞上增殖，不能在鼠源细胞上增殖。.本项目将fMHV S与受体识别区或嗜性功能相关区分别用α属中自然感染犬、猫和猪的三种CoV的相同功能区置换，构建重组病毒。研究重组病毒对不同宿主来源细胞的感染、受体结合程度，以及在细胞中的分布。确定α属CoV S的受体或嗜性相关功能区。然后将确定区域置换到β属的MHV的相应区域，确定该区域是否也与属间病毒跨宿主感染有关。.本项目通过对跨宿主感染相关的功能区域更精确的定位，进一步了解CoV跨宿主感染的分子机制，对了解病毒的宿主谱演变有重要意义。

冠状病毒S蛋白通过识别与结合受体在很大程度上决定了CoV感染宿主的特异性，但是仍有一些病毒可以感染多个宿主。例如，甲型冠状病毒1的三个成员犬冠状病毒（CCoV），猫冠状病毒（FCoV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）均以氨肽酶 N（APN) 为受体，相互间识别不同动物来源细胞，造成跨宿主感染，是研究CoV 跨种属传播的理想模型。本课题利用该模型阐述了以下几个问题：.首先，通过比较TGEV, CCoV和FCoV在不同来源的细胞系的增殖水平发现，TGEV不但能在宿主猪ST细胞上增殖，也能在犬A72细胞增殖良好，形成明显的噬斑；但是CCoV和FCoV只能犬A72细胞增殖，对猪ST细胞感染明显受到限制。说明TGEV在宿主特异性与CCoV和FCoV存在较大差异，而CCoV和FCoV比较接近。.二，利用RNA定向重组技术，将TGEV S蛋白膜外区替代鼠肝炎病毒 (Mouse hepatitis virus, MHV) 同源序列成功获得了重组病毒（tMHV）。令人意外的是，tMHV在犬A72细胞的增殖明显，甚至高于野生型TGEV。tMHV在犬A72细胞形成典型噬斑，而在猪ST细胞形成针尖样噬斑。说明猪ST细胞对tMHV的限制不是因为TGEV S蛋白RBD与受体pAPN特异性所致。.三，S蛋白的信号肽比较分析发现，MHV与TGEV同源性明显高于与CCoV或FCoV的，但实验证明这种倾向并未对S蛋白的表达、分布和装配到病毒粒子有影响。导致tMHV不能在猪ST细胞形成典型噬斑，是因为MHV S蛋白膜内区导致重组S蛋白聚集在TGN，不能转移到细胞表面发生细胞-细胞膜融合产生合胞体病变。但在犬A72细胞重组S蛋白能定位到细胞膜。.此外，我们发现一个TGEV临床分离株ZH在ST细胞的复制水平明显比TGEV purdue低，二者的S蛋白和N蛋白也存在差异。通过将TGEV purdue N基因稳定转染ST细胞，发现TGEV-ZH和tMHV的增殖水平均明显提高，TGEV-ZH形成的噬斑增大。.综上所述，冠状病毒细胞感染特异性决定于细胞受体-S蛋白RBD相互作用，病毒导致的细胞病理变化与细胞能否将S蛋白转运至质膜有关，同时N蛋白也参与病毒对细胞适应性。因此，冠状病毒跨宿主感染需要多重因素共同完成，细胞受体起主要作用。