猪δ冠状病毒受体筛选、鉴定以及S蛋白介导的细胞入侵机制研究

Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is a novel coronavirus that causes diarrhea in.nursing piglets, with a 60% positive rate in clinical cases of diarrhea in young pigs. The disease is clinically similar to, but reportedly milder than porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and transmissible gastroenteritis virus (TGEV) in the affected nursing pigs. There are currently no evidence to show the receptor and infectious mechanism of PDCoV, and also there are no treatments or vaccines available for PDCoV. Our former experiments showed that PDCoV can grow on swine testis (ST) and porcine kindney (LLC-PK) cells with the addition of trypsin or pancreatin. But the functional receptor and invasion mechanism of PDCoV are still unknown. The goal of this project is to find the virus-binding cell-receptor, and investigate the proteolytic style and site of the spike protein, and find the receptor-binding region in PDCoV S protein, then to reveal the invasion mechanisms of PDCoV. These investigations will provide scientific basis for the development of new vaccines and drug design for PDCoV.

猪δ冠状病毒（PDCoV）是一种新发的猪肠道冠状病毒，主要引起10日龄以内仔猪腹泻，临床报道显示仔猪腹泻样品中PDCoV阳性率高达60%。作为新发现的病毒，其入侵宿主细胞过程和感染机制等方面仍是空白。我们前期研究结果表明PDCoV可感染猪睾丸（ST）细胞和猪肾（LLC-PK）细胞，但需要添加外源蛋白酶才能产生典型细胞病变，且外源蛋白酶在病毒的出芽释放阶段起重要作用，但是PDCoV识别的细胞受体及其介导的细胞入侵机制尚不清楚。本项目拟以PDCoV感染细胞为模型，应用基因定点突变、蛋白质二维电泳、质谱分析、免疫共沉淀等技术研究发现PDCoV感染识别宿主细胞的受体分子，确定PDCoV感染过程中S蛋白的酶解激活方式，解析PDCoV S蛋白受体结合域部位，揭示PDCoV S蛋白介导的细胞入侵机制，为药物设计和新型疫苗研制提供科学依据和突破口。

PDCoV属于冠状病毒科δ冠状病毒属成员，主要引起猪急性腹泻和新生仔猪死亡。PDCoV识别的细胞受体及其介导的细胞入侵机制尚不清楚。本项目以PDCoV感染的适应性细胞为模型，筛选PDCoV感染识别宿主细胞的受体分子，研究PDCoV S蛋白的酶解激活方式，解析PDCoV的细胞入侵机制。项目主要获得以下进展：1）通过病毒铺覆蛋白印迹试验并结合液相色谱串联质谱技术对PDCoV入侵宿主细胞的受体进行了初步鉴定，再通过荧光定量PCR、RNA干扰等试验筛选出猪氨基肽酶（pAPN）、热休克蛋白（HSP70）和唾液酸可能是PDCoV的入侵受体。2）通过对pAPN的研究发现在PDCoV的非易感细胞中过表达pAPN能促进PDCoV感染，且pAPN胞外域的domian2区域对PDCoV入侵的增强作用最明显，但是特异性抗体阻断试验和RNA干扰试验均不能完全抑制PDCoV感染易感细胞，提示pAPN在PDCoV入侵细胞过程中起着受体作用，但不是PDCoV入侵细胞的功能性受体。除了pAPN外，应该还存在其他PDCoV入侵受体。3）通过对HSP70的研究发现PDCoV感染可以诱导细胞HSP70的表达上调，过表达HSP70可促进病毒增殖，用HSP70特异性抑制剂处理细胞后可抑制PDCoV在细胞中的增殖，且PDCoV S基因表达水平下降，提示HSP70促进PDCoV的增殖可能与病毒的S蛋白有关。4）对唾液酸的研究发现细胞表面唾液酸能够促进PDCoV黏附在细胞表面，并首次发现胰酶会影响PDCoV S蛋白与唾液酸的结合能力，动物实验显示PDCoV和唾液酸在仔猪肠道上皮细胞中有共定位，说明唾液酸是PDCoV入侵宿主细胞的粘附受体。5）特异性内吞抑制剂Baf-A1可剂量依赖性的抑制PDCoV的感染，提示PDCoV可通过内吞途径入侵宿主细胞；将内吞途径抑制后可部分但不能完全抑制病毒的复制，加入外源蛋白酶可缓解这种抑制现象，说明PDCoV可以通过内吞途径和外源蛋白酶介导途径感染宿主细胞。6）PDCoV S蛋白能够通过酶促裂解进而促进PDCoV的感染，并通过生物信息学预测其裂解位点位于S蛋白R672-V683位之间。本研究揭示了PDCoV的细胞入侵机制，为药物设计和新型疫苗研制提供科学依据和突破口。