鼠冠状病毒S蛋白膜内区S-棕榈酰化的发生机制及功能调控作用

S-棕榈酰化（S-palmitoylation）是一种重要的蛋白翻译后修饰方式，与蛋白转运、膜融合、信号转导及神经突触等功能密切相关。然而，目前S-棕榈酰化研究主要集中在膜周蛋白，对跨膜蛋白S-棕榈酰化机制了解较少。我们前期工作发现，鼠冠状病毒S蛋白膜内区Cys残基数量与其S-棕榈酰化程度，邻近碱性氨基酸与其转运至细胞膜有关，提示二者可能构成S-棕榈酰化的双信号。本项目拟用已建立的突变蛋白及其表达体系，分析和筛选与S蛋白膜内区S-棕榈酰化过程相关的或参与S-棕榈酰化蛋白转运的细胞蛋白，验证双信号机制，阐明膜周蛋白与跨膜蛋白二者在S-棕榈酰化机制上的差异。另外，本课题拟通过蛋白定位与病毒学方法深入分析S蛋白在ER/Golgi定位富集后，定向进入病毒粒子（病毒复制）和转运至细胞膜上（细胞病理）的功能分化与S-棕榈酰化的关联，从新的角度了解包膜病毒在复制和致病间的平衡机制，为发现新药靶提供思路。

S-棕榈酰化（S-palmitoylation）是16C脂肪酸通过硫酯键连接到游离蛋白或跨膜蛋白的Cys残基上，这种修饰方式可提高蛋白质的膜结合能力，与蛋白转运、膜融合、信号转导及神经突触等功能密切相关。虽然发现大量蛋白发生S-棕榈酰修饰，但只有少数几种蛋白的功能证明与这些修饰的有关，S-棕榈酰修饰的生物学意义和发生机制仍有待进一步阐明。冠状病毒S蛋白膜内区富含半胱氨酸残基，已证明是S-棕榈酰化的位点，可作为蛋白S-棕榈酰理想模型。本课题利用RNA定向重组技术获得能同步表达外源基因的重组鼠冠状病毒，建立了跨膜蛋白S-棕榈酰化的机制研究与S蛋白功能分析系统。结果显示，S 蛋白膜内区Cys 残基数量与其S-棕榈酰化程度和复制能力有关，其邻近碱性残基参与了蛋白转运至细胞膜，而其末端酸性残基则与特异性装配至病毒粒子相关。另外，膜内区这种共同效应有利于S蛋白在ER-Golgi富集，最终导致重组病毒在异源细胞的致病性的差异。蛋白S-棕榈酰化的主要研究方法有两种：一是用2-溴代棕榈酸盐及其衍生物竞争抑制修饰反应，或者用其标记被修饰的蛋白然后进行鉴定,如近年来通过点击化学( Click chemistry )方法进行S-棕榈酰化蛋白谱分析；二是直接对S-棕榈酰化的细胞蛋白进行生物化学分析，如用羟胺裂解蛋白的修饰基团直接进行迁移率比较，或用活性生物素（如Biotin-BMCC）标记切割后的巯基，推测修饰的程度。本项目测试了多种方法，发现CO-IP结合羟氨处理鉴定重组蛋白的S-棕榈酰修饰程度比较稳定，其他方法变异较大。另外，2-BP可抑制病毒复制和重组蛋白表达，但对羟氨处理并无作用，因此其作为棕榈酰化酶( DHHC-PATs )的抑制剂的特异性有待进一步确定。同时，我们也发现2-BP作用效果明显受细胞培养基中血清影响，可能其中的BSA与之形成复合物不能进入细胞内所致。本课题结果从新的角度了解包膜病毒在复制和致病间的平衡机制，为发现新药靶提供思路。